褪黑素对Aβ诱导的大鼠脑组织GFAP和S100β蛋白表达的干预作用

　　　　 作者：周军 侯德仁 曾庆仁 陈坤 周丽 万顺 田怡

【摘要】 目的 观察褪黑素(MT)干预β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100β蛋白的表达，探讨MT对老年痴呆症(AD)治疗的作用机制。方法 30只大鼠随机分为生理盐水对照组、β淀粉样蛋白(Aβ)诱导AD模型构建组(模型组)和AD模型+MT治疗组(MT组)。动物喂养40 d时取大鼠脑组织，用HE染色观察脑组织病理变化，免疫组化染色法检测Aβ标记的脑组织部位以及Aβ对神经细胞毒性作用，同时检测胶质细胞的GFAP和S100β蛋白的表达水平。结果 HE染色观察脑组织病变在MT组明显轻于模型组;免疫组化结果显示，Aβ的表达水平在模型组和MT组二者间无明显差异，但Aβ对海马CA3区神经元损伤作用在模型组要大于MT组。GFAP和S100β表达水平在模型组则显著高于MT组和正常组(P&<0.05)。结论 用MT干预治疗，可降低AD模型鼠胶质细胞表达GFAP和S100β蛋白的水平，从而起到了减轻大脑神经元细胞的损伤作用。

【关键词】 褪黑素; 老年痴呆症;β淀粉样蛋白;星形胶质细胞

　 阿尔茨海默病(AD)是一种常见的老年痴呆症，主要表现为认知能力丧失以及神经病理性结构损伤，包括脑组织萎缩、老年斑和神经纤维缠结与大量的β淀粉样蛋白(Aβ)沉积。AD是威胁老年群体健康与寿命的最重要的疾病之一〔1〕，目前尚无有效治疗方法，因此深入开展对AD发病机制研究和寻找有效治疗方法具有重要意义。研究证明年龄老化和脑组织中Aβ沉积是促使AD发生发展的主要原因，与机体氧自由基产生增加、清除氧自由基能力下降等因素有关〔2〕。神经胶质细胞构成中枢神经系统微环境，活化后可分泌大量细胞因子，释放氧自由基、激活补体，启动免疫反应，在AD的病变中起重要作用。褪黑素(MT)是一种重要的抗衰老激素，可有效地防止大脑功能退化，减少与年龄相关的炎症基因表达增长，并诱导抗氧化的基因生成;能通过血脑屏障，且价廉又无明显毒副作用〔3〕。考虑到MT具有巨大的潜在效应，故有可能成为一种极好的用于研究治疗AD疾病的化合物。本实验在观察Aβ所引起神经毒作用的同时，重点探索MT干预Aβ诱导大鼠脑组织表达GFAP和S100β两种蛋白水平的影响，以了解MT在Aβ沉积在脑组织所发挥的作用，为治疗AD提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 纤维型Aβ1～42的制备 取0.5 g Aβ1～42(美国Sigma公司)溶于250 μl注射用生理盐水中，用电动混悬器充分混匀，置于37℃恒温箱中孵育1 w，使其成为聚集状态的纤维型Aβ1～42，置4℃冰箱中备用。

　　1.2 动物分组及模型制备 成年SD雄性大鼠30只，体重180～220 g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，其中随机取20只建立AD模型，10只作为正常对照组。建模方法：将SD大鼠用10%水合氯醛 (0.35 mg/kg)麻醉后置于立体定位仪上，切开皮肤，找到前囟所在位置，参考大鼠图谱确定前囟后3.0 mm，中线旁2.0 mm为海马的所在的体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，将微量注射器固定在立体定位仪上，进针约2.8 mm，缓慢均匀注入纤维型Aβ1～42溶液10 μg/5 μl，5 min注射完毕，留针5 min，然后缓慢撤针，术后缝合皮肤。对照组按照模型制备的全过程在脑内注射生理盐水5 μ1。建模成功后随机分为模型组和MT用药组，与正常组均平行给予常规饮食及正常活动。模型组和对照组均灌胃1 ml生理盐水，MT用药组用褪黑素0.15 mg/kg(生理盐水配制)灌胃，每次1 ml/d，持续40 d。

　　1.3 脑组织切片的制备 模型建立40 d后，将对照组、MT组和模型组三组大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)麻醉，暴露心脏，经左心室灌注0.01 mol/L PBS，待大鼠的肝脏颜色变浅，然后改以4%的多聚甲醛灌注，流速约为10 ml/min，并取脑组织置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定过夜，次日用0.01 mol/L PBS反复浸洗，最后将脑组织梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，冠状切片(厚约5 μm)备用。

　　1.4 免疫组织化学主要试剂和实验方法 取脱蜡切片入PBS缓冲液，经抗原修复液(美国Vector，H3300)80℃存放20 min，待自然冷却后，缓冲液清洗2次，再入3% h3O2室温下5 min，以消除内源性过氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清中1 h，以减少组织非特异性反应。实验中所用抗体6E10购于美国Covance 公司(产品编号：SIG39340，1∶1 000);NeuN购于Chemicon公司(产品编号：MAB377，1∶1 000);S100β购于Sigma，产品编号：S2657，1∶100)，GFAP购于美国DAKO公司(Z0334，1∶1 000)。切片分别在 1%小牛血清与0.1% Triton和上述抗体的混合液中4℃冰箱孵育过夜，次日经缓冲液洗涤3次后，加相应二抗(1∶400)溶液，室温孵育1 h，缓冲液洗涤3次后，加生物素与卵白素结合(ABC)试剂盒配置的混合液中再孵育1 h。底物呈色反应采用DAB试剂盒。所有二抗、ABC和DAB试剂盒均购自美国Vector公司。呈色反应后，切片经逐级脱水并用加拿大中性树胶封片。

　　1.5 图像采集及统计学分析 在日本产Nikon Eclipse 80i显微镜下观察结果，并用Nikon DS高分辨率数码相机经NISElements AR 3.0软件拍照。对脑组织切片均通过拍照收集皮质和海马切面图像。结果分析，采用Ver.3.00程序软件作图像数字采集及半定量分析。结果评估采用单一方差分析，Excel软件统计制表。

　　2 结 果

　　2.1 Aβ在模型组和MT组脑组织的表达 6E10(Aβ1～16)抗体标记脑组织的溶解或聚集状态Aβ。显微镜下观察在对照组未发现Aβ的沉积，而模型组和MT组可见海马中央以及皮质中线旁2 mm处可见有大小不等分布不均的6E10抗体阳性反应物表达，两组比较没有明显的差异，见图1。

　　2.2 MT对Aβ的神经细胞毒性影响 在模型组和MT组的Aβ注射的脑组织皮质区和海马CA3区可见神经细胞大小不一，部分神经细胞萎缩变形，神经细胞带受损，细胞数量减少，对照组未发现上述改变，见图2。

　　图1 Aβ在各组脑组织的表达(DAB，×100)图2 MT对Aβ的神经细胞毒性影响(DAB，×400)

　　2.3 各组大鼠脑组织GFAP与S100β蛋白的表达 GFAP和S100β蛋白在各组大鼠脑组织均有表达，GFAP在对照组的阳性反应细胞数量较少，细胞染色较浅，MT和模型组两种蛋白的阳性反应细胞增多，染色反应增强，脑组织海马和皮质部位均有明显的表达，两组反应与对照组相比较，差异有统计学意义(P&<0.05)，见表1，图3，图4。表1 各组大鼠脑组织中6E10、GFAP和S100 β表达(x±s)

　　3 讨 论

　　已知脑内发挥神经毒作用的Aβ主要是Aβ1～40和Aβ1～42。虽然实验用Aβ是人工合成，但不少研究证明它几乎和内生性的Aβ1～42有同等毒性作用，以聚集状态的Aβ诱导的神经元退行性病变与AD的病理改变十分相似〔4〕。本实验通过以纤维型Aβ进行大鼠背侧细胞带微量注射，Aβ1～42以不溶解状态成大分子而不被吸收，用免疫组织化学的方法用6E10抗体反应证实Aβ存在模型鼠大脑皮质和海马区。Aβ1～42是具神经毒性的蛋白，有长期的相对稳定性，保留在脑组织内持续性的可导致神经毒性作用，使脑组织神经细胞退行性变，注射皮质区和海马可见Aβ沉积，表明模型成功。本研究结果显示，注射区神经细胞大小不一，有的呈萎缩状态，皮质局部有些神经细胞死亡消失，胶质细胞浸润，海马CA1区神经细胞有局部缺损，CA3的部位更明显，神经细胞萎缩变形使细胞带受损，同时神经细胞数量减少，胶质细胞增多。

　　星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的一种胶质细胞，担负了胶质细胞的大部分功能，与脑功能的维持密切相关。传统观点认为星形胶质细胞主要功能在于对神经元起营养和支持作用，星形胶质细胞在脑组织受损伤时会明显增加，以维持大脑的正常功能〔5〕。最新研究发现星形胶质细胞的过度活化可加重AD的进展。星形胶质细胞的活化主要表现为AS数量增加、分泌的蛋白表达增强、胞体膨胀增大、分支增多等〔6〕。而主要表达在星形胶质细胞的S100β是生理状态下神经元发育和轴突生长中发挥重要的作用蛋白之一，近年来临床病理分析却发现S100β随年龄有上升趋势，AD患者的S100β含量远高于正常老年组〔7〕。S100β蛋白对细胞功能的调节作用依赖于浓度水平，低浓度有神经营养和保护作用，高浓度S100β具有神经毒作用，表现在升高神经细胞内钙离子浓度，诱发神经元变性、神经细胞凋亡或坏死。因此，S100β蛋白的过度表达多通常作为神经退化性疾病的一个标志〔8〕。本实验结果显示，聚集状态的Aβ诱导星形胶质蛋白和S100β蛋白生成增加，而S100β通过自分泌的影响反过来刺激星形胶质细胞的分裂增殖，致模型组大鼠脑组织S100β蛋白和GFAP表达的阳性细胞数较对照组明显增多，提示AS被Aβ激活，这可能在Aβ所致的AD发生发展过程中起重要作用。

　　本研究发现，外源性给予Aβ1～42可损伤神经元，并导致脑组织GFAP和S100β两组蛋白含量增加。经MT干预治疗后，减轻了神经元损伤和减少了GFAP和S100β的阳性反应程度。随着对AD的不断认识，单纯的神经元变性不能解释AD整个病程。胶质细胞活化、氧自由基 和NO与凋亡等在AD发病中可能起着同样重要的作用〔9〕。褪黑激素是松果体的分泌产物，在神经退化疾病中有保护神经元的作用，也是人类天然的抗氧化剂，除以电子供体直接清除氧自由基外，同时也能够影响氧化和抗氧化有关酶类的活性，起到间接抗氧化作用〔10〕，提示MT除通过清除自由基和抗氧化，还可抑制GFAP和S100β过表达，减少炎症因子的产生及细胞凋亡和损伤，从而保护神经细胞。补充MT可改善由Aβ诱导的神经毒作用。

参考文献

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