核因子κB与细胞间黏附分子1在人冠状动脉粥样硬化斑块中的表达及与病变进展的关系

　　　　 作者：白玉 王中群 姚文健 赵卫星 孙雷

【摘要】 目的 探讨炎症因子核因子κB(NFκB)、细胞间黏附分子1(ICAM1)在冠状动脉粥样硬化病变发生、发展中的作用及两因子间的潜在关系。方法 从55例尸检标本中获得55个冠状动脉标本。用免疫组织化学的方法检测NFκB、ICAM1在各组冠脉中的表达情况。结果 正常冠状动脉NFκB、ICAM1不表达，在冠状动脉粥样硬化斑块中NFκB、ICAM1表达均增加(P&<0.05)，且两者在内膜中的表达强度呈正相关(r=0.738，P=0.000)。结论 NFκB、ICAM1参与了冠状动脉粥样硬化斑块的发生与演进。NFκB作为引发炎症的关键转录因子有可能上调了ICAM1的表达。

【关键词】 冠状动脉粥样硬化斑块; 核因子κB; 细胞间黏附分子1

　动脉粥样硬化(AS)是血管内皮损伤导致的慢性炎症性血管疾病〔1〕。内皮损伤引起内皮细胞表面黏附性改变，表达细胞间黏附分子1(ICAM1)等多种黏附分子，诱导单核细胞黏附，是AS形成的始动环节〔2〕。核因子κB(NFκB)是多种炎症和免疫反应相关基因的重要转录调控因子，参与AS炎症反应的放大与持续。既往对NFκB、ICAM1的研究多集中于动物实验〔3〕，尚缺乏应用人体冠状动脉标本的实验资料。实验拟采用人冠状动脉粥样硬化的标本，通过免疫组织化学检测方法，分析AS发生时NFκB、ICAM1在人冠状动脉局部表达情况并分析两者相关性，为今后临床有效地对冠心病进行诊断、治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂 选取2006至2008年大连医科大学病理与法医学教研室尸检冠状动脉左前降支的蜡块标本，共55例，正常冠脉15例，AS冠脉40例，平均年龄(64.2±5.4)岁。鼠抗人NFκBp65、ICAM1单克隆抗体购自Santa Cruz公司。鼠抗人αactin、CD68单克隆抗体、免疫组化链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 组织学检测和分组 选定标本经常规10%甲醛固定，脱水、透明、石蜡包埋及切片，并进行HE染色。光镜下观察切片，根据管腔狭窄程度分为四级：Ⅰ级&<25%，Ⅱ级26%～50%，Ⅲ级51%～75%，Ⅳ级&>75%。再根据病史和镜下病理特征按照组织学病理分类标准将55例标本分为3组。A组：正常冠脉，15例;B组：冠脉狭窄程度≤50%，18例;C组：冠脉狭窄程度&>50%，22例。

　　1.2.2 免疫组织化学检测 采用SP法，石蜡切片脱蜡和水化后，3%h3O2甲醇消化内源性过氧化物酶的活性，修复抗原，0.5%小牛血清白蛋白封闭非特异性抗体，滴加一抗，滴加生物素化的二抗，滴加链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶，DAB 显色、水洗、苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。显微镜下观察。

　　1.3 结果判定 ①平滑肌细胞判定：依据αactin染色阳性的细胞，判定为平滑肌细胞。②巨噬细胞判定：依据CD68染色阳性的细胞，判定为巨噬细胞。③NFκB和ICAM1的阳性结果判定：参照许良中〔4〕等的免疫组织化学反应结果的判定标准，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判断结果。根据显色程度判断阳性强度：基本不着色者为0分;着色淡黄色者为1分;棕黄色者为2分;棕褐色者为3分。按阳性细胞所占计数细胞百分比计分：0分为无阳性细胞，阳性细胞≤10%计1分，10%&<阳性细胞≤50%计2分，50%&<阳性细胞≤75%计3分，阳性细胞&>75%计4分。染色强度与阳性细胞计分乘积0分～2分记为(-)，3分～5分记为(+)，6分～9分记为()，10分～12分记为()。

　　1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件χ2检验、非参数等级相关性(Spearman)检验。

　　2 结 果

　　2.1 NFκB在冠状动脉内膜中的表达情况 NFκB在A组无表达，而在病变组的冠状动脉内膜中表达增强。通过αactin和CD68定位，显示主要表达在内皮细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、平滑肌细胞，阳性反应部位为胞核，见图1、表1。表1 NFκB在各组内膜的表达情况图1 NFκB在各组内膜的表达情况(DAB，×400)

　　2.2 ICAM1在冠状动脉内膜中的表达情况 ICAM1在正常对照组无表达，在病变组的冠状动脉内膜中表达增强。通过αactin和CD68定位，显示主要表达在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞的胞浆及胞膜，见图2、表2。

　　2.3 NFκB和ICAM1在冠状动脉粥样硬化内膜区域表达相关性分析 在正常冠状动脉内膜中NFκB和ICAM1均无表达，在AS病变内膜区域中二者均有表达，并且两者在内膜中的表达强度呈正相关关系(r=0.738 P=0.000)，见表3。图2 ICAM1在各组内膜的表达情况(DAB，×400)表2 ICAM1在各组内膜表达情况表3 NFκB和ICAM1在冠状动脉粥样硬化内膜中的表达

　　3 讨 论

　　正常血管内皮的管腔面相对于血液是一个非黏附性的屏障，在各种致AS因子的作用下，内皮细胞受损并被激活，可表达多种细胞黏附分子。ICAM1是活化的内皮细胞表达的重要黏附分子之一。我们观察发现，ICAM1的表达与巨噬细胞的浸润有一定关系，ICAM1作为AS重要黏附因子主要在AS早期发挥作用。因此，我们推测ICAM1可能是白细胞黏附和迁移的前提条件，ICAM1调节白细胞的相互作用、迁移和黏附，在AS形成的早期发挥重要作用。

　　研究显示，在冠脉内膜无明显增厚的AS初期，NFκB主要表达于内皮细胞及内皮下的少量巨噬细胞，推测NFκB可能作为炎症转录因子介导单核细胞与内皮细胞的黏附〔5〕。本实验结果显示，在AS进展期，NFκB主要表达于粥样斑块的肩部及纤维帽，尤以在巨噬细胞和泡沫细胞处表达最为明显，说明NFκB在巨噬细胞浸润及粥样斑块形成的过程中起到了主要的作用，Ⅲ～Ⅳ级狭窄表达阳性率高于Ⅰ～Ⅱ级狭窄，提示冠状动脉病变程度可能与炎症介质释放量有关。由于NFκB对AS中多种炎性介质的表达起着关键性的调控作用，所以AS中NFκB的含量和活性升高可增强多种炎症因子的转录和生成增多，引起持续的炎症反应，促进粥样斑块的形成和发展，加重病变程度。

　　本实验发现，人AS内膜可见NFκB、ICAM1的表达强度都显著增加，且均在巨噬细胞浸润的区域高度表达，两者表达存在正相关性，表明NFκB、ICAM1参与了人的冠状动脉粥样硬化的形成和发展，并且NFκB作为关键的核转录因子可能调控了AS血管壁中ICAM1的转录表达。业已证实，ICAM1基因启动子上含有NFκB结合位点〔6〕，各种细胞外的刺激信号使胞浆中未活化的NFκB激活并进入胞核，NFκB的p50亚基的核定位序列与ICAM1的κB位点发生特异性结合，NFκB含有转录激活区的p65亚基能启动ICAM1的转录，ICAM1又可反过来进一步活化NFκB，由此形成一个正反馈调节，二者协同参与了冠状动脉粥样硬化的发生发展。

参考文献

　1 Ross R.Atherosclerosisan inflammatory disease〔J〕.N Engl J Med，1999;320 (2):11523.

　　2 Libby P，Aikawa M.Evolution and stabilization of vulnerable atherosclerotic plaques〔J〕.Jpn Circ J，2001;65(6):473.

　　3 王中群，崔 静，李丽华，等.Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(13):166972.

　　4 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准〔J〕.中国癌症杂志，1996;6(4):22931.

　　5 Sun J，Huang YQ.Role of nuclear kappa B signal pathways in process of atherosclerosis〔J〕.Mode J Integ Trad Chin West Medi，2007;l6(15):215862.

　　6 于运福.动脉粥样硬化中的核转录因子NFκB〔J〕.实用诊断与治疗杂志，2006;20 (4):277.