【摘要】 目的：探讨硫酸氨基葡萄糖(GS)对大鼠软骨细胞体外增殖的影响。方法：采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养，并对第四代细胞进行药物干预，利用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）、流式细胞术检测细胞周期等方法检测各代次大鼠软骨细胞和药物干预后第四代软骨细胞的增殖情况。结果：大鼠软骨细胞随传代培养，MTT比色显示增殖呈下降趋势，免疫细胞化学检测PCNA表达减少，流式细胞术显示细胞增殖指数下降；硫酸氨基葡萄糖可以抑制这一趋势，促进传代培养的细胞增殖能力。结论：GS对传代培养的大鼠软骨细胞的增殖能力有明显促进作用。
【关键词】 硫酸氨基葡萄糖；大鼠；软骨细胞；增殖
Abstract Objective: The purpose of the present paper was to investigate the effect of glucosamin sulphat(GS) on the proliferation of rat chondrocyte in vitro. Methods: The rat articular chondrocytes were isolated by enzyme digestion and sub-cultivated in serial. The 4th chondrocyte was interfered with GS. The chondrocytes of different generations and the 4th medicine intefered generation were detected with such methodsas PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ， MTT(methyl thiazolyl tetrazolium) assay for proliferation and Flow cytometry for analyses of cell cycle distribution and PI(proliferation index). Results: With rat chondrocytes sub-cultivated， MTT assay showed that the proliferating ability of chondrocytes decreased， the express of PCNA tapered in the experiment of immunohistochemistry， as well as PI descended in flow cytometry for analyses. GS can inhibit the tendency and strengthened the proliferating ability of chondrocytes in serial subcultivation. Conclusion: GS can significantly improve proliferation of chondrocytes in serial subcultivation.
Key words Glucosamin sulphat(GS); Rat; Chondrocyte; Proliferation
关节软骨缺损是临床上的常见损伤，它可导致关节面不平整，从而继发骨性关节炎。用组织工程软骨修复关节软骨缺损是目前正在尝试的一种新方法，具有良好的发展潜力。关节软骨细胞是组织工程理想的种子细胞，但如何分离获取数量多、活性高、分化良好的软骨细胞是组织工程培养技术中的重要问题之一。近年来对生长因子在关节软骨形成和退变过程中的作用日益受到重视，并开展了广泛的研究，认为种子细胞需要适应生长因子的调控才能获得良好的生物活性。硫酸氨基葡萄糖是关节软骨生物合成和刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质，被认为是第一个改变骨关节炎病情的药物。本研究采用体外培养大鼠软骨细胞的方法，观察硫酸氨基葡萄糖对其增殖的影响，为优化组织工程的种子细胞提供一定的理论和实验依据。
1 材料
1.1 实验动物
清洁级SD（Sprague-Dawley）大鼠：福建医科大学实验动物中心提供（闽验证字20050001，合格证号2005C03，清洁级），3～4周龄，体重180～200g，皆为雄性，共8只。
1.2 主要试剂
αMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清（FBS，HyClone公司）；胰蛋白酶1∶250(Amersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司)；噻唑蓝（MTT，上海申能博采公司），二甲基亚砜(Amersco公司)；增殖细胞核抗原 (PCNA，美国NeoMarkers公司)；硫酸氨基葡萄糖(浙江海正药业)。
2 方法
2.1 大鼠软骨细胞的获取、鉴定与药物干预分组情况
取4周龄体重185～200g的SD大鼠，断颈处死，参考Hu等［1］软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3日首次换液，8～10 天达85%融合后进行传代培养。以传代次数（passage，P）分组，P0即原代细胞，P1即第1次传代后细胞，P2即第2次传代培养细胞，余类推。软骨细胞鉴定采用阿力新蓝染色法检测GAG合成、免疫组化法及RT－PCR法检测Ⅱ型胶原表达［2］。实验分组为P2组、P3组、P4组及硫酸氨基葡萄糖不同剂量组（低、中、高不同药物浓度干预后的P4软骨细胞组），硫酸氨基葡萄糖干预组分组的方法采用传代分组法：倒置相差显微镜下进行观察，当P3代软骨细胞融合达到85%时进行传代（1传3），以胰酶消化贴壁细胞，反复吹打，使细胞均匀悬浮，离心（1 500rpm，5 min），洗涤2次；对αMEM（含5%FBS）进行加药，配制含不同浓度的GS培养基，分别加药使各瓶培养基药物终浓度为GS 5mg/mL、GS 10mg/mL、GS 15mg/mL；分别以上述不同含药浓度培养基吹打混匀各瓶P3细胞，进行传代，使药物干预组软骨细胞进入P4代。按实验要求调整细胞浓度，分别接种软骨细胞于底面积25cm2培养瓶（细胞浓度5×105/mL）、6孔培养板（置入盖玻片，细胞浓度5×105/mL）、96孔培养板（细胞浓度4×105/mL）， 于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中孵育，其中硫酸氨基葡萄糖分组参考剂量来源于Largo R等［3］、Mattei M等［4］及Dodge GR等［5］实验研究。
2.2 各代软骨细胞MTT比色试验
将不同代次大鼠软骨细胞以5×104/mL浓度接种于96孔培养板中，常规培养24h后用含体积分数为5%FBS的αMEM培养，分别加入硫酸氨基葡萄糖，使硫酸氨基葡萄糖终浓度为5、10、15mg/mL，加药后分别继续培养48h，加入MTT溶液显色。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各个孔光吸收值。
2.3 各代软骨细胞周期分析及增殖指数检测
将培养的待测各代软骨细胞分别置5mL试管中，用PBS或生理盐水洗2次，制成单细胞悬液，无水乙醇固定细胞，加入PBS调整细胞浓度为5×105～5×106个细胞，加入1mL DNA荧光染料（PI），室温下避光染色15 min，以流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan，美国)分析各代软骨细胞周期及检测增殖指数。
2.4 各代软骨细胞免疫细胞化法检测各组软骨细胞PCNA表达
将不同代次软骨细胞接种于6孔板，孔内均预置一块盖玻片，常规培养48h后取出盖玻片，用免疫组织化学二步法检测PCNA表达情况。结果分析：采用HPIAS21000高清晰度图像处理系统进行图像分析，测定PCNA阳性信号的面积密度( Sv =PCNA阳性信号面积和/窗口面积×窗口数)。
2.5 统计学方法
以上检测均随机取多个样本，每个样本多次重复。应用SPSS11．0统计软件进行分析。进行Oneway ANOVA检验和Pearson相关分析，定量资料实验结果以均数±标准差表示，P&<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组软骨细胞MTT比色结果
MTT比色分析显示，随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中细胞能量代谢呈下降趋势，逐代相比OD值差异有统计学意义（P&<0.01）；硫酸氨基葡萄糖干预后的P4软骨细胞各组比之P4组能量代谢均有显著提高（P&<0.01），其中GS 10mg/mL组促进能量代谢的作用最为显著（P&<0.01），见图1。
3.2 各组软骨细胞细胞增殖指数结果
流式细胞术实验结果显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代细胞，细胞增殖指数呈下降趋势，分别为20.9%、16.8%、12.6%;GS干预后的P4各组细胞增殖指数高于P4细胞，分别为18.7%、19.4%、15.5%，其中GS 10mg/mL组促进软骨细胞增殖的作用最高。
3.3 各组软骨细胞PCNA检测结果
免疫细胞化学法检测各组软骨细胞PCNA表达显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中的阳性表达呈下降趋势，逐代相比其阳性表达有显著差异（P&<0.01）；硫酸氨基葡萄糖干预后的P4软骨细胞各组比之P4组PCNA阳性表达有显著提高（P&<0.01），其中GS 10mg/mL组促进PCNA阳性表达的作用最为显著（P&<0.01），见图3、图4。
4 讨论
维骨力（Viartil-s）是意大利罗达公司研发的用于治疗骨性关节炎的对因治疗的药物，该药既能抗炎止痛，又能延缓骨关节炎发展的作用，被认为是第一个改变骨关节炎病情的药物，又因体外实验证实其对软骨代谢有良好作用，也称之为软骨保护剂。其主要成份为硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS），是关节软骨生物合成和刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质［3］。而聚氨基葡萄糖和透明质酸是形成关节中蛋白聚糖所必需。GS的主要成分为“D－葡糖胺”，它是一种小分子化合物，容易透过生物膜，且与关节中的软骨有很强的亲和力，并与关节中的蛋白多糖分子结合。研究表明它能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，GS制剂可抑制胶原酶及磷脂酶A2活性，阻断超氧化物自由基产生及抑制蛋白水解酶活性，是阻止破坏软骨、肌腱、韧带的主要因素，补充软骨基质的丢失成分，抑制炎症过程，缓解疼痛，改善关节功能［6-8］。
实验所见软骨细胞在体外传代培养过程中细胞增殖能力呈下降趋势，本实验从MTT比色分析细胞能量代谢，流式细胞术考察其增殖期细胞含量，免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原表达等方面看到从P2代细胞至P4代细胞，软骨细胞增殖能力明显下降，如何以生长因子刺激促进软骨细胞的增殖能力对于将软骨细胞作为种子细胞用于软骨组织工程具有积极意义。
生长因子对靶细胞的调控与其剂量密切相关，因此，确定能产生最佳调控软骨细胞增殖的硫酸氨基葡萄糖剂量至关重要。本文在预实验的基础上用MTT比色试验所筛选的不同剂量的硫酸氨基葡萄糖能不同程度地促进软骨细胞的能量代谢。说明硫酸氨基葡萄糖能促进软骨细胞增殖，而且以GS 10mg/mL浓度为最佳。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达和合成与细胞周期有关。主要表达增殖细胞的S期、G1期、G2初期，因此成为检测细胞增殖活性最为有效的标志之一。本实验免疫组化结果证实，硫酸氨基葡萄糖以10mg/mL浓度时软骨细胞表达致密的棕褐色颗粒最多，其他组则较少，说明硫酸氨基葡萄糖可通过促进PCNA表达来调控DNA复制。细胞周期与细胞中DNA含量密切相关，DNA含量随着细胞周期各期而发生变化。当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变。细胞增殖指数是S期与G2期DNA含量之和与S期、G2及G1期DNA含量的之和的比，它是反映细胞增殖的重要指标之一。本实验FCM结果显示，硫酸氨基葡萄糖能显著提高软骨细胞增殖指数，且以10mg/mL浓度时最明显。
综上所述，硫酸氨基葡萄糖不仅具有显著的生物活性，可以促进软骨细胞的增殖，而且还能阻止软骨细胞在连续体外培养过程中的增殖衰老趋势。本实验可以为优化组织工程中的种子细胞提供一定理论和实验依据，有关硫酸氨基葡萄糖抗软骨细胞传代老化的实验有待进一步探讨。
参考文献
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