作者：杨文杰 王学智 岳秀兰 白晓荃
【摘要】 目的：探讨贲门癌C-erbB-2癌基因扩增情况及其临床意义。 方法：应用差别PCR技术检测32例贲门癌C-erbB-2癌基因扩增。 结果：贲门腺癌C-erbB-2扩增率为50%；贲门癌C-erbB-2基因扩增与组织学分化程度、浸润程度均无关（P＞0.05），与淋巴结转移有关（P＜0.05）。结论：C-erbB-2癌基因扩增与贲门癌发生有密切关系，原癌基因C-erbB-2扩增可作为贲门癌淋巴结转移的生物学标志。
【关键词】 贲门癌；C-erbB-2；差别PCR；癌基因扩增
Abstract Objective：To explore the amplication of C-erbB-2 oncogene in Gastric cardia adenocarcinoma（GCA） and its clinical significance.Methods:Oncogene C-erbB-2 amplification was examined by differential polymerase chain reaction in 32 cases of GCA. Results:16 out of 32 cases of GCA were found to have C-erbB-2 amplification. C-erbB-2 amplification in GCA was not correlated to histology differentiation and invasion degrees， but to lymph node metastasis. Conclusion: These results suggest that there is a close relationship between amplification of C-erbB-2 and GCA，and amplification of C-erbB-2 may be a biological marker for lymphatic matastasis in the patients with GCA.
Key words Gastric cardia adenocarcinoma；C-erbB-2；Differential polymerase chain reaction；Oncogene amplification
贲门癌（gastric cardia adenocarcinoma，GCA）是我国常见的恶性肿瘤之一，是指发生在胃贲门部，也就是食管胃交界线下约2cm范围内的腺癌。它是胃癌的特殊类型，但它又与其它部位的胃癌不同，具有自己的解剖组织学、病理学特性、临床表现、独特的诊断和治疗方法。GCA预后极差，中晚期患者5年生存率仅10%，侵袭和转移是GCA患者死亡的主要原因。现有研究表明，胃癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌均伴有不同程度的C-erbB-2扩增，并与肿瘤的发生发展、转移、预后有关。贲门癌与C-erbB-2扩增关系的研究在国内外未见相关报道。为了明确贲门癌与C-erbB-2扩增及临床病理关系，为临床诊断、治疗提供依据，我们进行了本次研究。
1 材料与方法
1.1 材料
收集包头市第七医院、赤峰市医院、内蒙古医学院第一附属医院手术切除并经病理诊断为贲门癌的新鲜组织32例作为研究对象。其中男24例，女8例；年龄51～76岁。取手术切除末端正常粘膜组织作为对照。所有标本均迅速剔除血块及脂肪组织，置于-20℃冰箱中冷冻保存。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂
TaqDNA polymerase、PCR Reaction Buffer、dNTP均为北京鼎国生物技术发展中心产品；引物由上海生工生物工程公司合成；DNA抽提试剂盒、Marker购自上海生工生物工程公司。
1.2.2 PCR模板制备
采用上海生工生物工程公司生产的UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒提取组织中DNA，作为PCR反应的模板。
1.2.3 差别PCR检测
引物：扩增C-erbB-2原癌基因的引物序列为A：5′-CCT CTG ACG TCC ATC ATC TC- 3′ B：5′-ATC TTC TGC TGC CGT CGC TT-3′扩增产物为98bp；扩增β-actin的引物序列为A：5′-ATC TTC TGC TGC CGT CGC TT-3′ B：5′-CCT CTG ACG TCC ATC ATC TC-3′扩增产物为318bp。PCR反应体系：总反应体系25μL，其中Mg2+浓度为2mM， dNTPs浓度为0.32mM， C-erbB-2及β-actin上下游引物终浓度0.33μM，TaqDNA polymerase(2U/μL)1μL，DNA模板液5μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL。PCR循环参数设置：预变性：95℃，2min；变性：94℃，1min；退火：55℃，1min；延伸：72℃，50s；最后延伸72℃，5min，共35个循环。PCR产物鉴定：取PCR产物15μL及5μL Maker，加入2μL载样缓冲液， 2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，电压100V，25min。紫外灯下观察，摄片。与Maker 100bp相对应的区带为C-erbB-2 (98bp)，与300bp相对应的区带为β-actin（318bp）。
1.2.4 C-erbB-2原癌基因扩增的判定
电泳结果应用KH-UVⅢ型紫外透射反射分析仪扫描，江苏省捷达科技有限公司的凝胶分析软件测定各区带的光密度值（IOD）。C-erbB-2基因相对拷贝数=C-erbB-2电泳区带光密度值/β-actin电泳区带光密度值，该比值×318/98为校正拷贝数。计算正常组织的校正拷贝数及其单侧99%正常值范围。计算肿瘤组织校正拷贝数，大于正常值范围上限者判定为扩增。
1.2.5 统计分析
应用χ2检验分析实验数据。
2 结果
2.1 校正拷贝数正常值范围及C-erbB-2原癌基因扩增的判定
测定32例正常组织C-erbB-2、β-actin光密度值并计算其比值、校正， C-erbB-2/β-actin电泳区带光密度比值为1.1±0.21，单侧99%正常值范围上限为1.58。凡贲门癌组织C-erbB-2/β-actin校正拷贝数&>1.58者即为扩增。
2.2 食管癌组织中C-erbB-2原癌基因扩增情况
32例贲门癌组织中有16例存在C-erbB-2扩增，扩增率为50%。
2.3 贲门癌中C-erbB-2基因扩增与临床病理的关系
C-erbB-2基因扩增与组织学分化程度、浸润程度差异均无显著性（P&>0.05），而与淋巴结转移有关（P＜0.05）。见表1。表1 c-erbB-2基因扩增与贲门癌临床病理的关系（略）
3 讨论
C-erbB-2原癌基因（又称neu/HER-2基因）定位于17号染色体q11.2～12.1上，编码分子量为185kD的跨膜磷酸糖蛋白，该蛋白具有酪氨酸蛋白激酶活性，能够使受体本身和胞浆的酪氨酸残基磷酸化，提供给细胞进行分裂的信号，引起细胞增殖分化。C-erbB-2原癌基因主要通过基因扩增的方式激活成为癌基因［1］。C-erbB-2扩增与mRNA及蛋白产物的高表达存在一致的关系［2］。
应用差别PCR技术检测贲门癌原癌基因C-erbB-2扩增率为50.0%，说明贲门癌与C-erbB-2扩增密切相关。C-erbB-2扩增率与乳腺癌(44.0%)、结直肠癌(48.1%)、胃癌( 47.1% )扩增率相近［3-4］，而与食管鳞癌(36%)相差较远［5］，可能是由于C-erbB-2参与了恶性肿瘤的发生过程，但在腺癌和鳞癌中所起的作用不同。
贲门癌中C-erbB-2扩增与浸润程度、分化程度无关（P值均大于0.05）。在胃癌、食管癌研究中也有C-erbB-2扩增与浸润程度、分化程度无关的相关报道［4-5］。提示C-erbB-2扩增未参与贲门癌的侵袭及细胞分化过程。贲门癌中C-erbB-2扩增与淋巴结转移相关，淋巴结转移者扩增率为63.6%，而无淋巴结转移者扩增率为36.4%，且两者差异具有显著性（P＜0.05）。在以往的报道中，乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌中C-erbB-2扩增与淋巴结转移有关［3-4，6］，有淋巴结转移者，C-erbB-2扩增率高。而食管鳞癌C-erbB-2扩增与淋巴结转移无关［5］。这些实验结果提示：C-erbB-2可能是参与了腺癌的转移；腺癌与鳞癌转移机制不同。所以，C-erbB-2扩增提示贲门癌预后不良，可以作为贲门癌淋巴结转移的生物学标志。
目前，贲门癌C-erbB-2的研究主要是利用免疫组化的方法检测C-erbB-2的表达。有学者研究结果显示贲门癌中C-erbB-2的表达与淋巴结转移、浸润程度相关而与分化程度无关。与本次研究结果得出的结论不同。免疫组化法不需特殊的仪器设备，容易获取样本，但费时费力、灵敏度低，重复性差、实验结果跨度大，这可能也是文献报道中研究结果有争议的原因之一。差别PCR（differential PCR）是新近发展的技术，具有简便、客观、灵敏度高、重复性好等优点，在临床上有推广价值。
参考文献
［1］Fajac A，Benard J，Lhomme C，et al.C-erbB-2 gene amplification and protein expression in ovarian epithelial tumors evaluation of their respective progenostic significance by multivariate analysis［J］.Int J Cancer，1995，64:146.
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