【摘要】 目的：建立健康SD雄性大鼠肝纤维化模型， 探讨超声对肝纤维化无创定量诊断的价值。 方法: 于0周、2周、4周分别对以复合因子所建立27只健康SD雄性大鼠肝纤维化模型进行肝组织病理检查、超声检查及血清纤维化指标检查，以病理诊断结果为标准，探讨应用超声积分对肝纤维化无创定量诊断的价值。 结果: 以复合因子法成功建立了鼠肝纤维化模型，实验表明，超声积分与病理学肝纤维化分期相关性良好，超声总积分与血清肝纤维化指标联合应用，可使早期肝硬化诊断灵敏度及特异度提高。 结论: 超声积分及超声与血清肝纤维化指标联合应用对肝纤维化无创定量诊断有较高的价值。
【关键词】 肝纤维化;病理检查;超声检查;积分方案
肝脏活体组织学检查被公认为确定肝纤维化程度的金标准，目前，常规实施肝穿刺活检尚有相当难度，寻找无创定量诊断肝纤维化程度的有效方法在肝纤维化研究中倍受瞩目［1-2］。本实验以肝纤维化模型大鼠为研究对象，探讨超声对肝纤维化无创定量诊断的价值。
1 对象与方法
1.1 动物准备 健康雄性SD大鼠35只，重150～220g，平均180g，随机分五组，以复合因子致纤维化模型方法，建立鼠肝纤维化模型。造模方法：（1）以79.5%纯玉米粉加20%猪油、0.5%胆固醇制成低蛋白高脂肪高胆固醇混合饲料喂饲实验大鼠；（2）以10%乙醇（经白酒勾兑而成）为唯一饮用水喂饲实验大鼠；（3）第一次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.5mL/100g，以后每隔3天0.3mL/100g重复皮下注射40%CCl4植物油溶液，为期4周。按2000年制定的肝纤维化程度分期标准，以肝病理检查结果作为判断肝纤维化及划分肝纤维化程度的标准［3］。
1.2 仪器与方法 在建立肝纤维化模型前、2周、4周分别进行超声检查、血清纤维化指标检查及肝组织病理检查。（1）超声检查：每次超声检查前用8%硫化钠脱去肝区体毛，以2%戊巴比妥那4.5mg/100g腹腔注射，麻醉实验动物。采用Hp 5500型及IU22型彩色电脑超声诊断仪，成像频率2.0～4.0MHz，由同一操作者熟练测量各超声指标，计6个：肝实质回声、肝包膜回声、肝脏边缘、门静脉血流、脾脏、腹水，结果以磁光盘保存，脱机分析，分别计算每个实验鼠每次超声积分。彩色多普勒超声诊断实验鼠肝纤维化综合评分标准重点参考国内外多位学者研究结果制订［4］，见表1。
表1 超声综合指标诊断实验鼠肝纤维化综合评分标准（略）
1.3 纤维化指标检查 取鼠尾静脉血，采用酶联免疫吸附分析法，测定血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原肽（PCⅢ）。
1.4 组织病理学检查 建立肝纤维化模型前0周、2周在超声引导下进行肝组织活检，活检标本至少包含3个完整汇管区；在建立肝纤维化模型4周时处死动物后取肝标本。穿刺活检及肝标本均以10%甲醛液固定，石蜡包埋切片，HE染色后常规病理检查。肝纤维化的病理诊断标准采用2000年西安会议标准。
2 结果
35只SD大鼠，实验过程中因耐受不良死亡8只，共27只实验鼠造模成功最终纳入统计处理。实验鼠肝纤维化的超声总积分分布情况见表2。
表2 实验鼠肝纤维化的超声总积分分布情况（略）
χ2=25.325，P&<0.01，似然比33.325，P&<0.05
以肝纤维化病理诊断S4期作为早期肝硬化的诊断标准进行分析，结果显示：超声总积分大于12分，诊断早期肝硬化灵敏度92.3%，特异度91.7%。超声总积分与血清肝纤维化指标联合应用，可使早期肝硬化诊断灵敏度提高至96.5%，特异度提高至95.8%(图1)。
图1 各期肝纤维化鼠血清纤维化指标（略）
3 讨论
3.1 采用复合因子致肝纤维化模型方法，建立鼠肝纤维化模型 本造模方式中，CCl4是一种选择性肝细胞膜毒物，可使肝细胞发生凋亡、脂肪变性乃至坏死，直至肝脏汇管区和肝小叶内纤维组织增生和沉积，导致肝纤维化，从S1期至S4期逐渐加重；乙醇作为酶诱导剂，可增加其毒性作用；配以低蛋白、高脂肪、高胆固醇饮食，即可促使肝发生纤维化。本造模方式传统复合方法协同作用周期短，但多种因素同时作用，易导致鼠耐受性差，死亡率较高，成模率不高（60%），我们实验体会以10%白酒代替传统造模采用的30%工业用酒精，可降低死亡率，成模率有所提高（78%），另外体重200g以上的大鼠耐受力明显高于低体重（低于200g）者，死亡率分别为21%、30%，成模率分别为81%、70%，故选择动物适应以200g左右为宜。
3.2 初步探讨诊断肝纤维化程度的相关临床及影像学诊断指标 目前，利用超声评价肝硬变的研究较多且较深入［5-10］，但对于肝纤维化程度的超声研究尚未充分展开，相关报道不多［11-13］，对肝纤维化超声诊断价值及其评价指标尚存在争议。目前诊断肝纤维化标准仍是病理学诊断，但因其有创，可引起潜在并发症使其难以成为肝纤维化常规诊断方法。建立肝纤维化非创伤性诊断系统成为临床研究热点。本研究初步挑选6项超声指标，将其与病理学进行对照，评价各超声指标之价值。以初步挑选的指标为基础，进一步对有用指标与病理分期进行判别分析，结果显示出判断肝纤维化程度意义较大的4项独立性超声判别指标，表明超声指标可用以初步评价肝纤维化的程度。血清肝纤维化指标可在不同程度上反映肝纤维化的进程，但尚无一项指标可反映肝纤维化的全貌。肝纤维化时，细胞外基质的降解产物和参与肝纤维代谢的酶类释入血清，血清中这些基质成分可作为肝纤维化的标志物。HA是一种大分子葡萄胺多糖，是结缔组织机制的重要成分；LN是细胞外间质成分中的糖蛋白。血清肝纤维化标志物可反映肝纤维化活动性，其值与肝内活动性基质沉积多少有关，活动性肝纤维化时血清标志物质高于静止性肝纤维化，故不能单纯以此作为依据反映肝纤维化的全貌。
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