人SUMO2基因原核表达、 纯化及多克隆抗体制备

【摘要】 目的: 构建人SUMO2基因的原核表达载体， 纯化融合蛋白GSTSUMO2SUMO2并以其为抗原免疫家兔， 制备人SUMO2多克隆抗体。 方法: 用PCR的方法得到人SUMO2基因并克隆至pET41a(+)原核表达载体中， 转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GSTSUMO2SUMO2表达; 所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、 SDSPAGE电泳鉴定后， 免疫家兔制备抗血清， 分别采用ELISA、 Western blot检测抗体效价和特异性。 结果: 测序证实重组质粒pET41a(+)SUMO2SUMO2构建成功;SDSPAGE结果证实获得Mr为52 000的GSTSUMO2SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合， ELISA检测为阳性。 结论: 获得了人SUMO2蛋白及特异性多克隆抗体， 对进一步研究人SUMO2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。

【关键词】 人SUMO2 原核表达 蛋白纯化 抗血清

　　随着2004年诺贝尔化学奖授予给发现了泛素调节的蛋白质降解的以色列科学家阿龙·切哈诺沃、 阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯， 近年来， 对依赖于泛素及类泛素蛋白的翻译后修饰的研究成为了新的热点。其中， 小泛素相关修饰物（small ubiquitinrelated modifier， SUMO)与蛋白的共价连接是一种新的广泛存在的翻译后修饰形式， 并且在真核细胞的蛋白质修饰中具有重要意义。哺乳动物中发现4种SUMO 分子: 按发现顺序称为SUMO1、 SUMO2、 SUMO3和SUMO4。与泛素类似， SUMO也是通过与靶蛋白的结合起作用的， 但与泛素化介导的蛋白酶降解途径不同， SUMO化的结果并不是将蛋白分子降解， 而是通过修饰来增强它们的稳定性或者调节其亚细胞定位， 以及影响蛋白质的转录活性， 从而发挥更加广泛的功能， 比如核质转运、 细胞周期调控以及信号转导等［1］。目前为止， 我们知道的SUMO化修饰的底物还只是一小部分被明确鉴定， 而且我们对已知的SUMO化修饰在改变许多蛋白的稳定性、 定位、 活性等的机理和功能上还存在很多疑问。尤其是对SUMO2/3的具体作用及其与SUMO1在功能上的差异还知之甚少， 因而我们通过构建SUMO2的原核表达载体， 获得GSTSUMO2融合蛋白并进行纯化， 由此得到人SUMO2的特异性多克隆抗体， 为进一步研究SUMO2的功能及其与家族其他成员的差异打下了良好的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒PET41a(+)、 大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3) plysS（本实验室保存）， pEYPFSUMO2（雷鸣教授惠赠）， 新西兰大白兔（体质量2.5～3.0 kg）2只。　　小量质粒提取试剂盒、 DNA纯化回收试剂盒均为博大泰克公司产品; 限制性内切酶Noc I及Xho I， T4连接酶、 Taq DNA聚合酶、 pfuDNA聚合酶、 标准相对分子质量(Mr)蛋白均购自大连TaKaRa有限公司; IPTG购自北京索莱宝科技有限公司; 卡那霉素购自北京鼎国生物工程公司; 硝酸纤维素膜为德国Whatman公司产品; 小鼠GST单克隆抗体（mAb）、 HRP标记的羊抗兔、 兔抗鼠抗体购自北京博奥森生物技术有限公司; GSTbind column购自Amersham公司; 凝血酶购自 Sigma公司; 其他常规试剂为国产分析纯试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计及合成 根据GenBank ( Genbank I D: NM_006936) 中人SUMO2基因cDNA序列， 克隆其ORF中活性蛋白区域即其162 bp 至441 bp序列， 设计合成两对引物， 引物序列如下， 第一对上游引物P1: 5′CCG CCA TGG GA ATG TCC GAG GAG AAG3′; 下游引物P2: 5′TAT GGA TCC ACC TCC CGT CTG CTG3′; 其中上游引物含有Nco I限制性酶切位点， 下游引物含有BamH Ⅰ限制性酶切位点。第二对上游引物P3: 5′TTC GGA TCC ATG TCC GAG GAG AAG3′; 下游引物P4: 5′TAT CTC GAG TTA ACC TCC CGT CTG CTG3′; 其中上游引物含有BamH I限制性酶切位点， 下游引物含有Xho I限制性酶切位点。另为做重组质粒检测用， 又合成了PET41a(+)的通用引物S.Tag primer #699453（记做Ps）:C GAA CGC CAG CAC ATG GAC AGC T7 terminator primer #693373（记做Pt）:ACC GCT GAG CAA TAA CTA GCA引物合成由上海英俊生物工程公司完成。

　　1.2.2 人SUMO2基因原核表达载体pET41a(+)SUMO2SUMO2的构建 以pEYFPSUMO2质粒为模板， 进行常规PCR扩增， 扩增条件为: 94℃预变性3 min， 94℃ 变性30 s、 55℃复性30 s、 72℃延伸30 s、 30个循环后， 72℃ 延伸6 min终止反应。 取PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳， 用凝胶成像仪检测电泳结果。
　　
　　将回收纯化的SUMO2 第1对PCR产物和原核表达载体pET41a (+)分别用Nco I和BamH I 酶切后， 从琼脂糖凝胶回收pET41a(+)片段和PCR产物片段， T4连接酶连接(4℃， 过夜) 用含卡那霉素的抗性培养基筛选， 构建重组质粒pET41a(+)SUMO2。同样方法， 将回收纯化的SUMO2第二对引物扩增的PCR产物和已构建好的重组质粒pET41a(+)SUMO2分别用BamH I和Xho I酶切后， T4连接酶连接(4℃， 过夜)， 用含卡那霉素的抗性培养基筛选， 构建重组质粒pET41a(+)SUMO2SUMO2， 其N端与GST标签形成融合蛋白。

　　1.2.3 大肠杆菌转化及重组质粒的鉴定 制备超级感受态DH5α和BL21 (DE3) pLysS细胞， 转化重组质粒pET41a(+)SUMO2和pET41a(+)SUMO2SUMO2。挑取转化菌落培养， 提取质粒分别经Nco I、 BamH I双酶切和BamH I、 Xho I双酶切以及pET41a(+)的通用引物Ps和Pt进行PCR检测， 鉴定载体中是否插入目的基因。含目的基因的重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

　　1.2.4 融合蛋白GSTSUMO2SUMO2的诱导表达 将测序正确的GSTSUMO2SUMO2重组质粒转化表达菌株BL21(DE3) pLysS， 选取阳性克隆于液体LB培养基中37℃振荡培养至A600=1.0时， 加入IPTG至终浓度1 mmol/L， 在28℃下诱导5 h后收获菌液。离心收集细菌， 用SDSPAGE鉴定蛋白。

　　1.2.5 融合蛋白GSTSUMO2SUMO2的纯化 将诱导表达的1 000 mL菌体培养液4℃， 10 000 g， 10 min离心收集菌体， 弃上清， 反复冻融法裂解细菌， 依次加入20 mL PBS缓冲液， 0.2 mL TritonX100及0.2 mL蛋白酶抑制剂PMSF完全融化和重悬冰冻细胞沉淀， 待细胞裂解完全后加入DNAase和RNAase。在变性条件下（加DTT至终浓度1 mmol/L）按公司GST亲和层析柱试剂盒的操作方法进行表达融合蛋白的纯化， -70℃储存备用。

　　1.2.6 多克隆抗体的制备及纯化 按常规方法免疫家兔。首次免疫时， 按每只1 mg的剂量， 将纯化得到的GSTSUMO2SUMO2溶于PBS(终浓度为2 g/L)中， 加入等体积的弗氏完全佐剂， 充分乳化后背部皮下及腹股沟多点注射; 每点≤100 μL乳化抗原。加强免疫， 抗原用量同初次免疫， 加弗氏不完全佐剂， 于前次免疫后的2周进行。最后1次加强免疫后的10 d后放血， 取血清。免疫血清用蛋白A亲和层析柱进行纯化， -20℃保存。

　　1.2.7 多克隆抗体鉴定 (1)Western blot鉴定: 将BL21 (DE3) pLysS表达产物经SDSPAGE电泳后， 采用电转移（60 V， 2 h）将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(NC 膜)上， TBS洗涤1次， 然后用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h， TBS洗涤3次， TTBS洗涤1次， 加入纯化后的兔抗SUMO2多克隆抗体4℃过夜， TBS洗涤3次， TTBS洗涤1次， 然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温温育1 h ， TBS洗涤3次， TTBS洗涤2次， DAB显色液显色。(2)ELISA检测: 用碳酸盐缓冲液稀释至1 mg/L， 按照100 μL/孔的量包被到聚苯乙烯反应(PVC)板上， 4℃过夜包被; 用PBST洗涤3 次， 然后按照200 μL/孔的量加入封闭液; 用PBST洗涤3次， 每孔加入100 μL倍比的免疫血清， 正常兔血清作为阴性对照， 每个样品设2个复孔， 37℃孵育2 h; 用PBST洗涤3次， 每孔均加入100 μL PBS(含1 g/L BSA)稀释的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗， 1∶4 000稀释， 博奥森生物技术有限公司公司)， 37℃孵育1 h; 用PBST洗涤3次， 加入50 μL OPD显色液， 室温避光显色10～15 min， 用25 μL 2 mol/L的硫酸终止反应; 在490 nm波长下用酶标仪读数。

　　2 结果

　　2.1 pET41a(+)SUMO2SUMO2原核表达载体的构建 利用PCR方法， 用第1对引物P1/P2从pEYPFSUMO2质粒中扩增出302 bp大小的DNA片段， 与预期Mr大小相符(图1A1)。以Nco I/BamH I分别双酶切PCR产物和质粒pET41a(+)， T4连接酶连接2者酶切回收后产物(4℃， 过夜)， 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态后， 挑单克隆， B型质粒快速提取试剂盒法提取质粒pET41a(+)SUMO2。同样方法， 用第2对引物P3/P4从pEYPFSUMO2质粒中扩增出300 bp大小的片段(图1A2)， 以BamH I/Xho I分别双酶切PCR产物和质粒pET41a(+)SUMO2， 4℃过夜连接， 转化得重组质粒pET41a(+)SUMO2SUMO2。

　　2.2 pET41a(+)SUMO2SUMO2原核表达载体的鉴定 用Nco I、 BamH I双酶切及pET41a(+)的通用引物Ps和Pt进行PCR检测pET41a(+)SUMO2， 其中PCR结果为pET41a(+)载体本身部分片段+SUMO2插入片段共计487 bp， 酶切结果为上方5.9 kb， 下方300 bp (图1B)。
　　
　　用Nco I、 Xho I双酶切及pET41a(+)的通用引物Ps和Pt进行PCR检测pET41a(+)SUMO2SUMO2， 其中PCR结果为pET41a(+)载体本身部分片段+SUMO2SUMO2插入片段共计775 bp， 酶切结果为上方5.9 kb， 下方602 bp(图1C)。将酶切及PCR检测结果阳性的质粒pET41a(+)SUMO2SUMO2中目的基因序列测序。 结果表明， 目的基因SUMO2SUMO2正确插入pET41a(+)， 并保持正确的读码框架。

　　图1 重组质粒PCR及双酶切鉴定（略）

　　Fig 1 Restrictive mapping and PCR of recombinant plasmid pET41aSUMO2SUMO2

　　A: M: DL 2 000 marker; 1，2: PCR of Sumo2 by P1/P2 and P3/P4.　　B: 1: PCR of PET41aSumo2 by Ps/Pt; M: DL 2 000 marker; 2: Restrictive mapping of PET41aSumo2 by Nco I， BamH I. C: 1: PCR of PET41aSumo2Sumo2 by Ps/Pt; M: DL 2 000 marker; 2: Restrictive mapping of PET41aSumo2Sumo2 by Nco I， Xho I.

　　2.3 IPTG诱导目的蛋白的表达 按前述方法进行目的蛋白GSTSUMO2SUMO2的诱导表达， 经过不同的IPTG 诱导浓度、 诱导时间和诱导温度的筛选(数据未列出)， 在终浓度1 mmol/L的IPTG， 28℃诱导5 h后蛋白产量达到高峰。收获的菌液中有Mr约51 900左右的GSTSUMO2SUMO2蛋白， 而未诱导的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌液中未见此蛋白表达（图2）。

　　2.4 融合蛋白的纯化及凝血酶酶切鉴定 用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化GSTSUMO2SUMO2融合蛋白(图3A)，　　第2泳道为菌体裂解液离心后的上清液即可溶性蛋白， 目的蛋白的表达基本上是以可溶蛋白为主。第1泳道Mr约52 000且条带单一， 说明纯化效果很好而且正确。将融合蛋白GSTSUMO2SUMO2经凝血酶酶切后SDSPAGE电泳检测蛋白（图3B）。其中第3、 4泳道为酶切过后的融合蛋白， 都在Mr 26 000和36 000处显示两条带（箭头所示）， 分别为酶切后的GST和人SUMO2SUMO2蛋白片段， 说明融合蛋白表达正确。

　　图2 GSTSUMO2SUMO2融合蛋白的表达（略）

　　Fig 2 SDSPAGE of the expression of fused protein GSTSUMO2SUMO2

　　1: pET41a(+)BL21(DE3)PlysS without induction; 2: pET41a(+)BL21(DE3)PlysS introduced by 1 mmol/L IPTG; 3: pET41a(+)SUMO2BL21(DE3)PlysS without induction; 4: pET41a(+)SUMO2BL21(DE3)PlysS introduced by 1 mmol/L IPTG; 5: pET41a(+)SUMO2SUMO2BL21(DE3)PlysS without induction; 6: pET41a(+)SUMO2SUMO2BL21(DE3)PlysS introduced by 1 mmol/L IPTG; M: Protein LMW marker.

　　图3 融合GSTSUMO2SUMO2的纯化及酶切验证（略）

　　Fig 3 SDSPAGE annlysis of fusion protein GSTSUMO2SUMO2

　　A: M: Protein LMW marker; 1: Fusion protein GSTSUMO2SUMO2 purified by affinity chromatography; 2: The supernatant of cell lysate， namely soluble protein; 3: Total protein. B: M: Protein LMW marker; 1: Thrombin; 2: Purified fusion protein GSTSUMO2SUMO2; 3， 4: Purified GSTSUMO2SUMO2 digest by thrombin.

　　2.5 多克隆抗体活性检测 (1)ELISA检测: 以纯化后的SUMO2蛋白为包备抗原， 间接ELISA法测定人SUMO2多克隆抗体效价(图4)， 结果表明经4次免疫后， 抗体效价约为1∶40 000。(2)Western blot 检测: 将纯化的融合蛋白以及经酶切后的GSTSUMO2SUMO2电泳后转膜， 分别用兔抗鼠GST mAb和制备的兔抗人SUMO2多克隆抗体作为一抗进行Western blot鉴定， 结果如图5所示。两图在Mr 52 000和26 000处都检验出条带， 应分别为GSTSUMO2SUMO2和GST蛋白， 而A图（IB: 兔抗人SUMO2多克隆抗体）还在Mr 36 000左右处(如箭头所示)检验出条带， 为抗体识别的SUMO2SUMO2蛋白。
　　图4 ELISA法测定人SUMO2多克隆抗体效价（略）

　　Fig 4 Determination of antibody titer applying

　　图5 Western blot鉴定抗人SUMO2多克隆抗体特异性（略）

　　Fig 5 The specificity of polyclonal antibody to Homo SUMO2 detected by Western blot

　　A: Anti Sumo2; B: Anti GST. M: Protein LMW marker; 1: Purified GSTSUMO2SUMO2 digested by thrombin; 2-4: Purified GSTSUMO2SUMO2.

　　3 讨论
　　
　　与蛋白质泛素化过程类似， SUMO化过程也需要其特异性蛋白酶切掉C末端双甘氨酸（GlyGly）后的氨基酸残基助其前体成为活化形式， 然后在E1、 E2和E3（E3是否一定需要尚不明确）［10］作用下结合到靶蛋白上。其中， SUMO2的开放阅读框（ORF）为其全长cDNA的162～473 bp， 在本实验中， 为了在后续实验中研究SUMO2功能的便利， 因而直接克隆其活性蛋白区， 即162～441 bp， 也就是表达终止在其双甘氨酸（GlyGly）处， 为SUMO2GG， 这样就保证了我们克隆区域的蛋白表达产物即使在没有外加SUMO蛋白酶的情况下也可以完全行使其生物学功能。与泛素类似， SUMO2也属于小分子蛋白， 其氨基酸残基仅为90多个， 这在抗体制备过程中就带来了难题， 因为其分子量太小就必然导致其免疫原性的降低， 因而所得到的抗体很可能效价不高。所以在本实验中， 我们大胆提出了抗原串联的方法， 即在表达载体pET41a(+)的多克隆位点处连续插入2个SUMO2片段， 以串联形式构成融合蛋白GSTSUMO2SUMO2， 这样就大大提高了抗原的免疫原型， 这一点从我们的ELISA检测中可以看出， 我们通过该方法所制得的人SUMO2多克隆抗体得到了比较满意的效价结果。
　　
　　SUMO在行使功能的过程中， 是否一定需要E3还未确定， 甚至在一段时间以前， 连是否存在E3都有过争议， 直到近几年在酵母和哺乳动物中陆续发现三种E3连接酶， 才平息了这种争议。值得注意的是， 已发现的几种E3连接酶都与特殊的亚细胞结构有关， 而在已经研究的比较清楚的SUMO家族的部分功能中， 调节靶蛋白的亚细胞定位是其一项重要功能， 在我们对SUMO家族进行进一步研究的时候， 利用免疫染色、 免疫印记等技术时就必须要有高效价、 特异性的SUMO蛋白抗体， 而现在的国内国际市场， 相关产品却十分罕见， 因而我们通过串联抗原方法所制得的高效价的SUMO2蛋白特异性多克隆抗体， 为SUMO2的进一步研究打下良好的基础。

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