【摘要】 目的: 通过检测尖锐湿疣（CA）组织中干扰素γ（IFN-γ）mRNA和白介素4( IL-4) mRNA的表达情况来研究其与尖锐湿疣复发的关系。方法: 以正常包皮组织作为对照， 采用原位逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测22例治疗后复发CA患者和14例未复发患者皮损中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA的原位表达情况。结果: CA患者皮损局部IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA的表达均高于正常对照组(P&<0.01); 复发组IL-4 mRNA的表达均高于未复发组， 未复发组IFN-γ mRNA的表达均高于复发组(P&<0.01)。结论: IFN-γ mRNA表达增高有利于CA的消退。
【关键词】 尖锐湿疣 IFN-γ mRNA IL-4 mRNA
［Abstract］ AIM: To study the expressions of interleukin 4 (IL-4) mRNA and interferon-gamma（IFN-γ） mRNA of condyloma acuminata in order to obtain a clue as to the immunological mechanisms possibly relevant for warts regression or persistence. METHODS: In situ RT-PCR was employed in surgically removed warts of 22 recurrent patients， 14 non-recurrent patients and 15 normal controls， respectively. RESULTS: The expression of IFN-γ mRNA in the non-recurrent warts was higher than in recurrent warts(P&<0.01); but the expression of IL-4 mRNA in the recurrent warts was higher than in non-recurrent warts (P&<0.01). CONCLUSION: A higher IFN-γ mRNA expression of condyloma acuminata lesions might contribute to warts regression.
［Keywords］condyloma acuminata; interferon-gamma mRNA; interleukin 4 mRNA
尖锐湿疣（condyloma acuminata， CA）目前尚无特效治疗方法， 治疗后复发率较高， 甚至迁延不愈， 然而少部分患者发病后即使未经治疗皮损也可自行消退［1］， 提示不同个体的免疫状态对CA的发生和复发可能有一定的影响。我们以干扰素γ（IFN-γ）代表Th1型细胞因子， 以白介素4(IL-4)代表Th3型细胞因子， 通过原位反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法研究IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA在复发性CA患者和非复发性CA患者皮损局部的表达。旨在探讨其和CA的复发的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司; Bio-11-dUTP购自华美生物技术公司; 蛋白酶K购自博士德公司。36例CA组织标本取自我院皮肤性病科患者。其中男21例， 女15例: 年龄21~41岁， 平均年龄(28.2±4.5)岁。首次就诊的CA患者， 用二氧化碳激光烧灼皮损治疗， 根据其激光治疗后随访12周内是否出现新发皮疹分为未复发组和复发组， 其中复发组22例， 未复发组14例。两组在年龄、 性别和病变程度等方面均具有可比性。以15例正常包皮组织作为对照。
1.2 方法
1.2.1 标本制备 治疗前取CA患者的皮损立即放入100 mL/L甲醛溶液中固定， 经透明、 浸蜡、 包埋， 然后连续切成5 μm厚切片， 贴附于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上备用。
1.2.2 引物合成 特异性引物由日本TaKaRa公司合成: IL-4引物序列: 正向 5′-CTT CCC CCT CTG TTC TTC CT-3′， 反向 5′-GAC TTT GCC GAG CTG TCC TT-3′; IFN-γ引物序列: 正向 5′-AGT TAT ATC TTG GCT TTT CA-3′， 反向 5′-TTC GAC TGA TTA ATA AGC-3′。
1.2.3 原位RT-PCR法 切片常规脱蜡至水后， 用1 mg/L的蛋白酶K消化组织20 min， 保持在25℃~37℃， 95℃灭活2 min后， PBS冲洗5 min。30 g/L过氧化氢溶液室温下阻断10 min， PBS冲洗5 min×3次。原位逆转录(RT)反应体系: AMV逆转录酶1μL; 2×PCR Buffer25μL; MgCl2(25mmol/L) 10 μL; dNTP5 μL; RNA酶抑制剂1 μL; 随机引物1 μL; 双蒸水7 μL。置恒温箱孵育， 30℃保持10 min， 42℃保持30 min， 迅速冷却至5℃。PCR反应体系: 2×PCR缓冲液25 μL; MgCl210 μL; dNTP4 μL; Bio-11-dUTP2 μL; Taq聚合酶1 μL; 上、 下游引物各1 μL; 双蒸水6 μL。循环参数: 90℃变性1 min， 55℃保持1 min， 72℃保持1 min， 共30个循环。然后72℃延伸10 min， 4℃保存。50 μL非免疫动物血清室温下封闭15 min; 链霉素抗生物素蛋白-过氧化氢酶溶液， 室温下孵育15 min， AEC显色液显色。阴性对照以PBS代替特异性引物作为质控标准。
1.2.4 结果判定标准 根据Shimizu法改良而成， AEC染色阳性细胞染成红色。着色范围以百分率记分≤1%为0， 2%～20%为1， 21%～50%为2， ≥51%为3; 着色强度依据深浅记分: 无着色为0， 浅着色为1， 深着色为2。上述两项相加为着色程度积分: ≤1.9为(-)， 2～2.9为(+)， 3～3.9为 (++)， ≥4为 (+++)。
1.2.5 统计学处理 表达阳性率采用精确概率法（Fisher’s Exact Test）进行检验; 表达程度积分值采用t检验。P&<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
不同CA组中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达程度的比较 CA患者皮损中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA阳性表达产物主要位于真皮中的淋巴细胞胞质及其周围， 表皮中阳性表达产物较少。对照组中IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA呈阴性表达。复发组IL-4 mRNA的表达率（91.0%）高于未复发组（42.9%）（P&<0.01）， 表达程度积分（3.04±1.25）也高于未复发组（1.64±1.60， P&<0.01）; 未复发组IFN-γ mRNA的表达率（78.5%）高于复发组(41.0%)（P&<0.05)， 表达程度积分（3.00±1.18）也高于复发组（1.27±1.42）（P&<0.01， 表1)。
表1 不同CA组中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达程度的比较（略）
Tab 1 IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA expression in different groups of CA
bP&<0.01 vs non-recurrent group; dP&<0.01 vs recurrent group.
3 讨论
研究发现， 10%~30%的CA患者发病后3个月即使未经治疗也可自行消退［1］， 这和部分患者病情迁延不愈形成鲜明对照， 不同患者的免疫状态对CA的预后有明显影响［2］。有关HPV的免疫学研究发现， 细胞免疫对于病毒的清除起主要作用。对CA患者全身性免疫功能的研究发现CA患者外周血中Th1型细胞因子IL-2、 IL-12、 IFN-α、 IFN-γ水平均下降［3 ，4］， 而Th3细胞因子IL-4、 IL-10表达明显升高［5］， 并初步认定CA患者在HPV感染后出现了全身性免疫受抑制现象， 即Th1细胞免疫功能下降。长病程CA患者与正常人及短病程患者患者相比其血清中IL-4水平升高， 而且CA治愈后血清中IL-4水平可恢复正常［7］。
CA是一种限局于生殖器肛门附近的病毒感染性疾病， 不引起病毒血症或全身受累， 其复发也主要局限于原发损害附近的皮肤黏膜。局部IFN治疗效果也好于全身用药， 故患者皮损处上皮的局部免疫功能， 尤其是局部的细胞免疫功能状态对其病程起着重要影响。而Th1分泌的细胞因子具有下调HPV的表达、 抑制HPV感染细胞的生长启动和诱发浸润白细胞的抗病毒作用， 是产生对CA皮损中的HPV病毒的有效免疫应答方式， 可促进HPV的清除［7］。
我们采用原位RT-PCR法进行研究发现: CA患者皮损处IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表达比对照组增高， 可能主要与CA皮损处炎症细胞尤其是淋巴细胞的大量浸润和活化有关。但在复发组和未复发组中这2种细胞因子的表达有明显不同， 未复发组中IFN-γ mRNA表达高于复发组中IFN-γ mRNA的表达， 而复发组中IL-4 mRNA表达高于未复发组中IL-4 mRNA的表达， 提示CA皮损中IFN-γ mRNA表达增加可使CA复发的比例降低。 Alfred等［5］发现CA患者对IFN治疗有效者皮损处Th1型细胞因子（IL-2、 IFN-γ）的mRNA表达高于IFN治疗无效者， 和我们研究的结论相同。Mark等［8］也发现部分宫颈处HPV感染者其可在数月后自动消退， 采用RT-PCR对其宫颈局部黏膜处的细胞因子mRNA进行检测证实， 所有自动消退的患者消退前宫颈局部显示有Th1型细胞因子IFN-γ的表达增加， 这也和我们的研究结果相似。IFN-γ和IL-4分别由Th1和Th3亚群产生。IL-4下调Th1反应， 促进Th3反应; 而IFN-γ可抑制Th3反应， 促进Th1反应。故和复发组相比， 未复发患者的皮损局部免疫类型表现为Th1型免疫反应更强。提示皮损局部IFN-γ mRNA表达增强时可以形成对局部HPV的有效的免疫， 减少CA的复发。
参考文献
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