人B 淋巴细胞刺激因子体外活性分析

【摘要】 目的: 分别采用MTT和ATPLiteTMM发光法分析人B细胞刺激因子对培养的小鼠脾细胞的生物学活性。方法: 分离小鼠脾细胞， 培养72 h后， MTT和ATP方法测定不同密度脾细胞的增殖， 从中选定适当的脾细胞密度分析BLyS活性。然后， 检测不同剂量的BLyS对脾细胞的刺激作用。结果: 用MTT和ATPLiteTMM发光法分析发现: BLyS在1、 5、 10和20 mg/L时， 都能明显促进小鼠脾细胞的增殖。结论: MTT法检测BLyS对小鼠脾细胞的增殖作用是一种简单、 快捷的方法。利用这种细胞模型， 可以对BLyS拮抗剂进行初步筛选以期获得具有潜在应用价值的治疗剂。

【关键词】 B细胞刺激因子 自身免疫性疾病 ATPLiteTM B细胞 MTT

　　B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator， BLyS)是TNF 家族中的一员[1]， 又称为B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family， BAFF)[2]， 由单核细胞和巨噬细胞持续合成、 分泌。BLyS以膜结合和可溶性两种形式存在。膜结合型BLyS由285个氨基酸组成， 经蛋白酶水解膜外区的133～134氨基酸残基肽链后， 可产生由152个氨基酸组成的可溶性活性多肽可溶性BLyS(soluble BLyS， sBLyS)， 进入血液循环。在体内、 外， sBLyS均具有特异地刺激B细胞的作用， 是B细胞发育、 存活所必需的[3]。而过量表达BLyS与某些自身免疫性疾病， 如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE)、 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)和口眼干燥综合征(Sjogren syndrome， SS)等有关[4]。在这些疾病患者血清中， BLyS水平也明显升高[5， 6]。目前， BLyS拮抗剂治疗SLE和RA正处在临床试验阶段， 有望成为治疗SLE和RA的新方法。
　　
　　本研究中采用MTT和ATPLiteTMM发光法， 探讨了人BLyS对小鼠脾细胞的作用。这将为进一步寻找潜在BLyS的拮抗剂提供了初步筛选的简捷方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BALB/c小鼠由军事医学科学院动物中心提供。可溶性BLyS(sBLyS)的原核表达载体及其空白质粒pET30a， E.coli BL21菌株由本室保存。镍螯合琼脂糖凝胶购自北京本元正阳基因技术股份有限公司。sBLyS的表达、 纯化参照文献[7]报道。ATPLiteTMM发光法试剂盒购自PerkinElmer life sciences公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠脾细胞的制备 取4～6周龄的小鼠， 脱臼处死后， 泡于750 mL/L乙醇中消毒。取出小鼠， 放置平板上呈俯卧位。用镊子夹起左侧皮毛部， 剪开皮肤、 腹膜， 分离脾脏， 放置平皿中。轻柔剪去脾脏两侧系膜及周围组织， 于平皿中加入1～2 mL生理盐水， 轻摇平皿洗涤。用平扁齿镊子轻挤压脾脏包膜， 将脾脏细胞挤至平皿中， 形成细胞悬液。预先于10 mL试管中加入3 mL小鼠淋巴细胞分离液， 再沿管壁缓缓加入6 mL细胞悬液，形成不同的液面层。2000 r/min室温离心30 min。轻轻环绕吸取界面细胞， 加入生理盐水6～8 mL， 混匀、 洗涤。1500 r/min离心5 min。弃上清， 所得沉淀即为脾细胞。

　　1.2.2 不同密度脾细胞增殖的分析 调整脾细胞密度为1×109、 2.5×109、 5×109、 1×1010和2× 1010细胞/L， 96孔板每孔分别加入100 μL， 于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养72 h。MTT法分析时， 在培养终止前6 h， 加入5 g/L MTT 10 μL， 继续培养至72 h， 每孔加入100 μL 100 g/L酸化SDS裂解细胞， 于酶标仪ELISAreader读取A570值。ATPLiteTMM发光法参照生产商说明书操作。每孔加入50 μL细胞裂解液， 轻轻振摇5 min; 再每孔加入50 μL底物溶液， 轻轻振摇5 min。光信号以每分钟计数(counts per second， CPS)为单位， 于Wallace 1420 multilabel counter VICTOR3(PerkinElmer， Singapore)仪测量。

　　1.2.3 BLyS对脾细胞作用的分析 每孔加入固定密度的脾细胞。再分别加入不同浓度的BLyS。以pET30a空载体表达的74个氨基酸组成肽作为对照。于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养72 h。同1.2.2， MTT和ATPLiteTMM发光法测细胞增殖。刺激指数(Stimulating index， SI)分别按以下公式计算: MTT法SI=(实验组A570－细胞本底A570)/细胞本底A570; ATPLiteTMM发光法SI=(实验组CPS－细胞本底CPS)/细胞本底CPS。

　　2 结果

　　2.1 脾细胞增殖曲线 测定了不同密度小鼠脾细胞的增殖， 以确定分析BLyS活性的适当细胞密度（图1、 2）。选取5×109细胞/L用作MTT法检测BLyS活性的脾细胞密度; 3×109细胞/L用作ATPLiteTMM发光法检测BLyS活性的脾细胞密度。

　　图1 MTT法检测小鼠脾细胞的增殖 （略）

　　图2 ATPLiteTMM发光法检测小鼠脾细胞的增殖（略）

　　2.2 BLyS具有刺激脾细胞增殖的活性 BLyS基因片段的表达产物带有来源于pET30a载体的56个氨基酸， 相对分子质量(Mr)大约26000。因此， 我们纯化了pET30a空载体表达的74个氨基酸组成的多肽， p30作为对照。纯化的p30 Mr大约10000（图 3）。

　　图3 纯化人重组BLyS蛋白和对照肽， p30的电泳图（略）

　　M: 蛋白marker; 1: 对照肽p30; 2: sBLyS.

　　每孔细胞培养液中加入不同浓度的sBLyS， 培养72 h， MTT法观察BLyS对脾细胞的刺激作用。BLyS在浓度为1、 5、 10 和20 mg/L时， 与对照相比， 能够明显刺激脾细胞增殖(P&<0.05， 图4)。 同样， ATPLiteTMM发光法分析显示: BLyS在5、 10和20 mg/L时明显刺激脾细胞增殖(P值分别为0.007812， 0.000346和0.01955) (图5)。

　　图4 MTT法检测BLyS对小鼠脾细胞的活性图5 ATPLiteTM法分析BLyS的活性（略）

　　3 讨论
　　
　　本研究中， 我们用MTT法和ATPLiteTMM发光法分析了人BLyS对培养小鼠脾细胞的作用。我们的结果显示ATPLiteTMM法比MTT法稍敏感、 快捷。但ATPLiteTMM法缺点是需要复杂的仪器和花费高。Batten等用流式细胞术分析了人BLyS促小鼠脾细胞存活的作用[8]。同样， 这种方法也需要复杂的仪器。MTT法相对简单， 也可以取得ATPLiteTMM法相似的结果。我们采用MTT法分析了自行设计的一种BLyS拮抗肽的作用[9]。因此， 利用这种小鼠脾细胞模型， 可以对潜在BLyS拮抗剂进行初步筛选， 以期获得具有临床应用价值的治疗剂。

参考文献

　　[1] Moore PA， Belvedere O， Orr A， et al. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator[J]. Science， 1999， 286(5425): 260-263.

　　[2] Schneider P， MacKay F， Steiner V， et al. BAFF， a novel ligand of the tumor necrosis factor family， stimulates B cell growth[J]. J Exp Med， 1999， 189(11): 1747-1756.

　　[3] 孙 剑. B淋巴细胞刺激因子[J]. 细胞生物学杂志， 2003， 25(2): 85-87.

　　[4] 孙 剑， 沈倍奋. B淋巴细胞因子与自身免疫性疾病[J]. 中国免疫学杂志， 2003， 19(11): 804-806.

　　[5] Cheema GS， Roschke V， Hilbert DM， et al. Elevated serum B lymphocyte stimulator levels in patients with systemic immunebased rheumatic diseases[J]. Arthrit Rheum， 2001， 44(6): 1313-1319.

　　[6] Groom J， Kalled SL， Cutler AH， et al. Association of BAFF/BLyS overexpression and altered B cell differentiation with Sjogren’s syndrome[J]. J Clin Invest， 2002， 109(1): 59-68.

　　[7] 孙 剑， 黎 燕， 冯建男， 等. 人可溶性B淋巴细胞刺激因子的克隆及在大肠杆菌中表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(2): 171-173.

　　[8] Batten M， Groom J， Cachero TG， et al. BAFF mediates survival of peripheral immature B lymphocytes[J]. J Exp Med， 2000， 192(10): 1453-1466.

　　[9] Sun J， Feng J， Yan LY， et al. A novel BLyS antagonist peptide designed based on the 3D complex structure of BCMA and BLyS[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 346(4): 1158-1162.