作者：陈运新， 黄月红， 陈治新， 郑伟达， 王小众
【摘要】 目的: 构建大鼠IL-10基因的真核表达载体， 观察其在大鼠肝细胞系BRL中的表达， 比较有无受体介导的脂质体的转染效率。方法: 抽提外周血单个核细胞的总RNA， 通过RT-巢式PCR方法获得大鼠IL-10的全长编码序列， 定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0， 并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。将重组质粒分别通过脂质体TransfastTM与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体PEIjet-gal转入大鼠肝细胞系BRL， 通过RT-PCR方法检测IL-10 mRNA的表达， 比较二者的转染效率， 用ELISA法检测后者分泌型IL-10的表达。结果: 经酶切及测序鉴定证实， 重组质粒插入片段与大鼠IL-10的全长编码序列完全相符。发现受体介导的脂质体PEIjet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体TransfastTM 。通过受体介导的脂质体转染， BRL细胞获得高水平的IL-10表达。结论: 成功地构建pcDNA3.0-IL-10重组质粒。受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性， 可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。
【关键词】 白细胞介素-10 基因治疗 去唾液酸糖蛋白受体 肝细胞
［Abstract］ AIM: To construct eukaryotic expression vector of rat IL-10 gene and observe its expression in hepatocyte cell line BRL. METHODS: Total RNA was extracted from rat peripheral blood mononuclear cells. The full length coding region of IL-10 was amplified by RT- nested PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0. The recombinant plasmid was transfected into BRL cells with either liposome TransfastTM or asialoglycoprotein receptor mediated liposome PEIjet-gal respectively. The expression of IL-10 mRNA was detected with PCR and that of IL-10 secreted from BRL cells transfected by liposome PEIjet-gal was detected with ELISA. RESULTS: The recombinant plasmid was identified and confirmed with digestion of restriction endonuclease and DNA sequencing. Receptor mediated liposome PEIjet-gal exhibited significantly higher transfection efficiency than liposome TransfastTM and higher level secretory IL-10 expressed in BRL cells. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector of IL-10 gene was successfully constructed. Asialoglycoprotein receptor-mediated liposome had high transfection efficiency on hepatocytes， suggesting that it could be a potential hepatocyte-targeting delivery system for IL-10 gene therepy.
［Keywords］interleukin-10; gene therapy; asialoglycoprotein receptor; hepatocyte
肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程。白细胞介素-10（IL-10）是一种具多效性的细胞因子， 在肝纤维化的进程中扮演重要的负反馈角色［1］。引入外源性IL-10也被证实对肝纤维化有拮抗作用［2］。但是由于重组IL-10半衰期很短， 难以在体内维持一个相对稳定的浓度; 静脉用药， 其作用缺乏肝脏靶向性。而探讨通过合适途径进行IL-10的基因治疗， 则有可能解决上述问题， 具有一定的应用前景。本实验中构建大鼠IL-10基因的真核表达载体， 并通过受体介导的脂质体和非受体介导的脂质体转染大鼠肝细胞系BRL， 观察IL-10的表达情况， 比较2种有无受体介导的脂质体的转染效率， 为下一步IL-10基因治疗肝纤维化的动物实验奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体pcDNA3.0由福建省消化研究室保存; 逆转录酶购自Fermentas公司; 高保真Taq酶、 限制性内切酶Hind Ⅲ、 BamHⅠ及T4连接酶均购自Promega公司; 质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司; 胶回收试剂盒购自上海中科开瑞生物芯片科技有限公司; PEIjet-gal转染载体购自polyplus公司; TransfastTM脂质体购自Promega公司， RNA抽提试剂盒购自Gentra公司; 大鼠IL-10 ELISA试剂盒购自Biosource公司; BRL是永生化的正常大鼠肝细胞系引自中国科学院上海细胞库。
1.2 方法
1.2.1 大鼠IL-10基因的获取 取SD大鼠外周血5 mL， 以Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞， 用RNA抽提试剂盒按说明书抽提总RNA， 并逆转录为cDNA作为模板， 设计两对引物， 用巢式PCR方法扩增出IL-10的全长编码序列（包括信号肽与功能肽）。外侧引物分别位于IL-10编码序列两端的外侧， 其扩增产物将作为内侧引物的模板; 而内侧引物恰位于编码序列两端， 并引入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点和Kozak序列。外侧引物序列: 上游5′-cgcagccttgcagaaaacagagc-3′， 下游5′-gctctatttatgtcctgcagtccag-3′， 产物片段为606 bp; 内侧引物序列: 上游5′-cgaagcttgccaccatgcttggctcagcac-3′， 下游5′-cgtctagatcaatttttcattttgagtg-3′， 产物片段为559 bp。后者扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳， 切下目的片段， 用胶回收试剂盒提取目的DNA。
1.2.2 IL-10-pcDNA3.0重组质粒的构建与鉴定 上述目的片段与pcDNA3.0空质粒均用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶进行双酶切，酶切条件为: 总体系20 μL， 含10×酶切缓冲液2 μL， BSA 2 μg， DNA 1 μg， Hind Ⅲ 5 U， BamHⅠ 5 U， 37℃ 4 h。酶切产物各自在琼脂糖凝胶上电泳， 用胶回收试剂盒提取较长片段。目的基因和质粒的回收片段按浓度比3∶1混合， 加入T4连接酶， 4℃过夜。以连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α， 并接种于氨苄青霉素阳性培养液。24 h后用接种针挑取部分菌落作为模板， 用IL-10内侧引物进行菌落PCR， 对扩增出IL-10的菌落之一进行增菌培养， 用质粒回收试剂盒按说明书抽提质粒， 用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切， 在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。并将重组质粒送测序鉴定（委托Invitrogen公司进行）。
1.2.3 PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体对BRL细胞转染效率的比较 转染前24 h调整细胞数， 将BRL细胞接种于6孔板中， 使转染时细胞铺满孔底的50%~60%。分别用 PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体将重组质粒转染BRL细胞24 h， 并于转染结束即时及之后1、 2、 4、 8、 12、 16 d用RNA抽提试剂盒抽提各组细胞的总RNA， 用RT-PCR方法检测IL-10的mRNA表达， 设立β-actin为内参照， IL-10引物为上述的内侧引物， β-actin引物序列: 上游5′-ccaaccgtgaaaagatgacc-3′， 下游5′-caggaggagcaatgatcttg-3′， 产物片段为660 bp。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳， 凝胶成像系统下观察。
1.2.4 重组质粒转染BRL细胞及分泌型IL-10的表达 转染前24 h调整细胞数， 将BRL细胞接种于6孔板中， 使转染时细胞铺满孔底的50%~60%， 更换2 mL含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养液备用。按PEIjet-gal转染体系说明书， 将重组质粒和pcDNA3.0空质粒分别转染BRL细胞， 每组3孔， 24 h后弃上清， 换2 mL含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养液。之后每24 h收集上清， 并换2 mL新鲜培养液。取转染后1、 2、 4、 8、 12、 16、 20、 24 d的上清， 用ratIL-10 ELISA试剂盒检测上清中IL-10的含量， 并绘制表达曲线。
2 结果
2.1 大鼠IL-10基因的获取 以IL-10外侧引物扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳， 未见明显片段。但以此扩增产物为模板， 用IL-10内侧引物进行扩增， 并在琼脂糖凝胶上电泳， 在紫外透射仪下见大约559 bp处出现一DNA片段。
2.2 IL-10-pcDNA3.0重组质粒的构建与鉴定 重组质粒用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切后， 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 显示有1条与目的基因Mr一致的DNA片段（图1）。测序结果在BLAST上比对显示， 插入片段序列与大鼠IL-10的编码序列完全一致。
图1 重组质粒pcDNA3.0-IL-10的酶切鉴定（略）
Fig 1 Restriction endonuclease digestion analysis of the recombinant plasmid pcDNA3.0-IL-10
1: pcDNA3.0-IL-10-plasmid digested by Hind Ⅲ/BamH Ⅰ; M1: 100 bp DNA marker; M2: λ-Hind Ⅲ DNA marker; 2: pcDNA3.0-IL-10 plasmid.
2.3 PEIjet-gal脂质体与TransfastTM脂质体转染效率的比较 TransfastTM脂质体组IL-10 mRNA表达较低， 在转染后2 d达到高峰（表达量仍低于β-actin）， 而后迅速下降， 第8天表达消失。而PEIjet-gal脂质体组IL-10 mRNA表达明显高于β-actin， 在转染结束即达高峰， 持续高水平表达至16 d后才开始下降， 到转染后20 d仍有较高表达（图2）。
图2 使用不同脂质体转染后BRL细胞中IL-10 mRNA的表达（略）
Fig 2 Expression of IL-10 mRNA in BRL cells transfected by different liposome
A: Transfect by liposome transfastTM; B: Transfect by liposome PEIjet-gal; M: DNA markers; 0， 1， 2， 4-16: 0， 1， 2， 4-16 days post transfection.
2.4 重组质粒转染后分泌型IL-10的表达 转染pcDNA3.0空质粒者几乎测不到IL-10的表达; 转染重组质粒者可检测到高浓度的分泌型IL-10的表达， 在转染结束后第2天达到高峰（12.78 μg/L）， 第4天即迅速下降， 第8天后保持长时间的低水平表达， 其表达曲线见（图3）。
图3 分泌型IL-10的表达（略）
Fig 3 Expression of secretory IL-10
3 讨论
IL-10是肝纤维化的重要拮抗因子。但是， IL-10在体内R半衰期仅数小时， 为了维持血药浓度， 需多次注射， 且费用昂贵。另外， 静脉注射IL-10作用缺乏靶向性。如果能将IL-10基因转移到合适的靶细胞内， 使其在肝脏较稳定的表达， 就可能解决上述问题。
肝纤维化的形成机制十分复杂， 有多种细胞参与其中， 除了起决定性作用的肝星状细胞（HSC）外， 还有肝细胞、 Kupffer细胞、 窦内皮细胞等［3］。我们认为肝细胞作为基因转移的靶细胞较为合适，基于以下几点考虑: (1)肝脏中， 肝细胞在数量上占绝对优势， 将其作为靶细胞， 可以保证目的基因在肝脏中的高表达; (2)肝细胞膜表面有一种特异性的去唾液酸糖蛋白受体， 为提高基因转移的靶向性提供可能［4， 5］; (3)肝细胞在解剖上与HSC毗邻， 在后者的激活与肝纤维化的进程中起着举足轻重的作用; (4)本实验室以往的研究显示， IL-10对肝纤维化动物模型及在体的HSC作用非常显著， 而单纯将IL-10直接作用于体外培养的HSC， 却影响甚微［6-8］。这提示IL-10对HSC的作用是一个多细胞、 多因子参与的过程， 而肝细胞可能在其中扮演重要角色。
基因治疗中， 载体和转染途径的选择至关重要。病毒载体普遍存在生物安全性问题; 另外， 目前比较常用的腺病毒载体虽然转染效率高， 但会引起强烈的免疫反应， 大大降低再次转染的效率。脂质体作为载体不存在上述问题， 但转染效率低。肝细胞膜上有高密度的去唾液酸糖蛋白受体， 可与半乳糖特异性结合。目前， 许多研究利用这一特性， 进行肝靶向药物递送或基因递送， 取得了很好的效果［9， 10］。jetPEITM-Gal转染体系是在阳离子脂质体上结合半乳糖， 使对肝细胞的靶向性和转染效率都大大提高。
我们通过巢式PCR方法扩增了在体内微量表达的IL-10基因， 成功构建了pcDNA3.0-IL-10重组质粒， 并转染体外培养的大鼠肝细胞系BRL， 获得了高水平的分泌型IL-10的表达。同时发现受体介导的脂质体可大大提高对肝细胞的转染效率， 延长IL-10基因的表达时间。为今后的动物体内实验奠定了基础。另外， 还发现转染后第4天开始出现IL-10 mRNA与蛋白表达的分离现象， 提示在后期存在翻译水平的抑制。这种抑制是否由于后期体外培养的细胞密度过高所致， 尚不得而知。动物体内实验是否也会出现这种分离现象， 有待进一步研究。
参考文献
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