信号转导和转录激活因子4及γ干扰素在银屑病患者皮损中的表达及其意义

　　　　 作者：李常兴，马泽粦，韩春雷，周志刚，胡斌

【摘要】 　　目的 研究银屑病患者皮损内信号转导和转录激活因子4(STAT4)及γ干扰素（IFNγ）的表达及其临床意义。方法 利用荧光定量聚合酶链反应法测定20例寻常型银屑病患者皮损内及17例正常对照者皮肤中STAT4 mRNA及IFNγmRNA的定量表达，采用直线相关回归分析方法分析STAT4mRNA及IFNγmRNA的表达与银屑病病情严重指数（PASI）的相关性，STAT4mRNA与IFNγmRNA表达的相关性。结果 银屑病皮损内STAT4mRNA及IFNγmRNA的表达均高于正常对照者皮肤内的表达水平（P＜0.001）。银屑病皮损内STAT4mRNA的表达与患者PASI呈显著的正相关(r=0.78465，P＜0.0001)， IFNγmRNA的表达与患者PASI无显著相关性(r=-0.16125，P=0.4970)。银屑病皮损内STAT4mRNA的表达与IFNγmRNA的表达呈显著的正相关(r=0.62149，P=0.0034)。结论 STAT4可能通过上调IFNγ的表达，促进银屑病的炎症进程。

【关键词】 银屑病 信号转导和转录激活因子4 γ 干扰素 荧光定量聚合酶链反应

　　【Abstract】 Objective To study the expression and significance of signal transducers and activators of transcription 4 (STAT4) and interferon gamma (IFNγ)in psoriatic skin lesion.Methods Twenty adult patients with vulgaris psoriasis and 17 health control were sequentially enrolled in this study. The production STAT4 mRNA and IFNγmRNA was detected by realtime polymerase chain reaction. The relationship between STAT4 and disease severity (PASI) was assessed by correlation analysis. The relationship between IFNγ and PASI was assessed by correlation analysis. The relationship between STAT4 mRNA and IFNγmRNA was assessed by correlation analysis.Results Expression of STAT4 mRNA and IFNγmRNA in psoriasis lesional skin was higher than that in control subject （P＜0.001）.Expression of STAT4 mRNA was markedly positive correlation with PASI(r=0.78465，P＜0.0001). Expression of IFNγmRNA was negative correlation with PASI(r=-0.16125，P=0.4970). Expression of STAT4 mRNA was markedly positive correlation with IFNγmRNA (r=0.62149，P= 0.0034).Conclusion Over expression of IFNγ might be regulated by STAT4. STAT4 might play an important role of in the development and advance of psoriasis.

　　【Key words】 psoriasis；signal transducers and activators of transcription 4；interferon gamma；realtime polymerase chain reaction

　　银屑病是一种慢性炎症性增生性疾病，严重影响着患者的生活质量，人群发病率为0.5%～4%，Th1/Th3型细胞因子平衡紊乱可能在银屑病发病过程中发挥着重要的作用［1，2］。信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)蛋白家族是近年来发现的一类转录因子，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等7个成员［3］。STAT家族作为转录因子和细胞因子发生作用的信号通路，是Th1细胞分化的关键调控因子之一，但STAT4在银屑病中的表达情况及其临床意义的研究甚少。本研究采用荧光定量PCR法定量测定STAT4及IFNγ在银屑病患者皮损内的表达及探讨其临床意义，现将结果报道如下。

　　资料和方法　　

　　1.一般资料

　　20例寻常型银屑病患者为2006年1～6月东莞市慢性病防治院皮肤科门诊患者（进行期），其中男11例，女9例；年龄范围20～46岁（平均36.8岁）；病程10天～3年。所有患者治疗前2个月内未系统应用免疫抑制剂或皮质类固醇制剂或中药机制；银屑病皮损严重指数（PASI）为8.9～48.6（平均30.1）。正常对照者17例为健康者外科整形手术切除的皮肤，其中男9例，女8例，年龄范围20～46岁（平均36.8岁）。

　　2.方法

　　（1）RNA的提取：组织块置匀浆器，加TRIZol冷冻匀浆，提取后的RNA置-80℃保存备用。

　　（2）RNA样品鉴定：电泳检查：每样品取5μl RNA置1%的琼脂糖凝胶上电泳，泳毕，溴化乙锭染色20 min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度。

　　（3）引物的设计和合成:参考16 sRND基因文库设计引物，STAT4引物序列如下：FO:5’- CAT TTG GTA CAA CGT GTC AAC CA -3’，RO:5’-TGT GGC AGG TGG AGG ATT ATT A -3’，引物扩增片断长度为70 bp，TaqMan Probe:5’-FAM-CGA TTC CCA GAA CTT GGT TTT CT-TAMRA-3’。 IFNγ引物序列如下：Forward Primer:5’-TAGCA ACAAA AAGAA ACGAG-3’，Reverse Primer:5’-CAGGA CAACC ATTAC TGGGA-3’扩增片断长度为117 bp，TaqMan Probe:5’-CCAAC GCAAA GCAAT ACATG AACT-3’，由ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。

　　（4）逆转录反应：取4 μl RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9700 PCR仪，反应体系如下： 5×逆转录buffer 4 μl，上游引物（10 pM/μl）0.4 μl，下游引物（10 pM/μl）0.4 μl，dNTPs（25 mM）0.2 μl，MMLV（10 U/μl）1 μl， DEPC水10 μl，总体积20 μl。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃3 分钟。

　　(5)荧光定量PCR反应体系进行：由荧光定量仪PE 7000型PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50μl，反应体系：5×定量PCR buffer 10μl，上游引物F1 μl，下游引物R 1 μl，dNTPs 0.5 μl，荧光探针1 μl，Taq 酶1.5 μl，cDNA 5 μl，ddh3O 30 μl。反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃45秒，55℃45秒，共40个循环。反应结束后，计算待测样本STAT4 mRNA及IFNγmRNA表达量(copy/μg RNA)。

　　3.统计学分析

　　采用SAS 8.01 for window 统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验和直线相关回归分析。

　　结果　　

　　1.两组STAT4 mRNA的表达 银屑病患者皮损内STAT4 mRNA的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达（表1）。表1 银屑病患者皮损和正常皮肤内STAT4mRNA的表达（略）

　　2.两组IFNγ mRNA的表达 银屑病患者皮损内IFNγ mRNA的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达（表2）。表2 银屑病患者皮损和正常皮肤内IFNγ mRNA的表达（略）

　　3.银屑病患者STAT4mRNA、IFNγmRNA与病情PASI的相关性 银屑病中STAT4mRNA表达与病情PASI呈显著正相关性(r= 0.78465，P＜0.0001)，银屑病中IFNγmRNA表达与病情PASI无显著相关性(r=-0.16125，P=0.4970)，银屑病患者皮损内STAT4mRNA的表达与IFNγmRNA的表达呈显著的正相关性(r=0.62149，P=0.0034)。

　　讨 论

　　银屑病是一种Th1细胞和Th3细胞平衡紊乱的炎症性疾病。大多数的研究显示银屑病患者外周血和皮损内以Th1细胞为主，Th1细胞因子抑制剂能有效的治疗银屑病［1，2，4，5］。银屑病皮损的炎症与T细胞介导产生的免疫反应有关，其皮损的表皮增殖与细胞凋亡异常相关：相关研究显示患者皮损内CD4+和CD8+T细胞表达过度［2］，笔者前期研究发现银屑病患者外周血CD4+、CD8+T细胞和CD4+/IFNγ+细胞表达明显升高，血清IFNγ含量明显升高并与PASI成正相关但与病程无关［2］，这些研究表明IFNγ可能参与了银屑病的发病。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有IFNγmRNA的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者。此外，银屑病患者皮损内IFNγmRNA的表达与病情严重程度呈显著的无显著相关性，与前期研究［2］的患者血清学表达的差异可能的原因有：①样本量不同，②血液和样本来源不同，③研究方法不同。提示银屑病患者体内Th细胞分化呈偏态性，以Th1细胞为主［1］。

　　患者体内IFNγ过度表达促进了银屑病皮损的形成和发展，但银屑病患者体内是通过何种信号途径促进Th细胞分化呈偏态性，如何促进IFNγ过度表达的研究甚少。STAT4是T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬／枯否细胞等免疫调控细胞内IL12／STAT4／IFNγ信号传导途径的关键组成元件，是IL12诱导免疫调控细胞产生IFNγ的关键调控因子。在STAT4基因敲除小鼠，IL12诱发的所有主要的T细胞和NK细胞功能反应均明显减弱，其中包括IFNγ产生减少与Th1型反应减弱；除此以外，STAT4还能调控T细胞IL12受体和IL18受体表达以及T细胞NFKB激活［6，7］。因此，STAT4作为IFNγ产生的关卡，通过直接与间接途径调控IFNγ的产生。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有STAT4mRNA的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者，与Eriksen等人［4］报道的基本一致。银屑病患者皮损内STAT4mRNA的表达与病情严重程度呈显著的正相关，即STAT4mRNA的表达量越高其病情越重，反之亦然。此外，银屑病皮损内STAT4mRNA的表达与IFNγmRNA的表达呈显著的正相关。这些研究结果表明，银屑病患者STAT4的过度表达可能直接与间接促进IFNγ的表达，进而促进了炎症细胞浸润，最终形成银屑病皮损。

参考文献

　　［1］张锡宝，何玉清，吴志华，等.银屑病患者外周血CD4+T细胞内干扰素γ、白介素4表达与发病的关系［J］.中华皮肤科杂志，2003，36(3): 151-153.

　　［2］李常兴，张锡宝，吴志华.甲氨蝶呤与银屑病［J］.岭南皮肤性病科杂志，2004，11 (02):200-203.

　　［3］Levy DE，Darnell JE Jr.Stats: transcriptional control and biological impact［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(9):651-562.

　　［4］Eriksen KW，Lovato P，Skov L.Increased sensitivity to interferon-alpha in psoriatic T cells［J］.J Invest Dermatol，2005，125(5):936-944.

　　［5］5. 马泽粦， 周志刚， 李常兴， 等. CXCR3在银屑病患者皮损中的表达及其临床意义［J］. 右江医学， 2007，35(4):362-364.

　　［6］Lawless VA，Zhang SM，Ozes ON，et al.STAT4 regulates multiple components of IFN- inducing signaling pathways［J］.J Immunology，2000，165(12):6803-6808.

　　［7］Fukao T，Frucht DM，Yap G，et al.Inducible expression of Stat4 in dendritic cells and macrophages and its critical role in innate and adaptive immune responses［J］.J Immunology， 2001，166(7):4446-4455.