他克林对急性胰腺炎大鼠血清细胞因子的影响研究

作者：汪建初，浦涧，潘小炎，韦忠恒，陆涛，马燕飞，韦邦宁，马日海

【摘要】 　　目的 探讨静脉注射他克林对急性胰腺炎大鼠细胞因子的影响。方法 健康Wistar大鼠108只，随机分为假手术组、对照组、他克林组各36只，分别测定三组动物模型建立成功后1 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h血清中TNFα、 IL6、IL10的含量变化。结果 假手术组各细胞因子均处于较低水平，对照组较假手术组各个时段细胞因子水平都明显升高（P＜0.05），而他克林组大鼠细胞因子TNFα、IL6在1 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h时也明显较假手术组升高（P＜0.05），但是其升高幅度与对照组相比明显降低(P＜0.05)。他克林组保护性细胞因子IL10在发病初1小时有升高，与对照组相比P=0.933；而在12～72 h，IL10升高明显，并逐步达到一定高度，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论 静脉注射他克林能够降低胰腺炎大鼠血清损伤性细胞因子TNFα、IL6的释放，升高保护性细胞因子IL10水平。

【关键词】 胆碱能抗炎通路 细胞因子 急性胰腺炎

　　【Abstract】 Objective To investigate how the cholinergic antiinflammatory pathway influncing the cytokine level in laboratory rats with pancreatitis. Methods 108 Wistar rats were randomly pided into sham group (SG)，control group (CG) and tacrine injection group(TG)，serum cytokines content variation of TNFα，IL6，IL10 in different period were determined.Results Serum concentrate of cytokines in SG keep a low level，but what in CG were higher than that in SG， which is signifficant statistically(P＜0.05).The concentrate of TNFα，IL6 in TG were higher than that in SG，in each period（P＜0.05）.But much lower than that in CG (P＜0.05). Serum level of IL10 in TG start rising in 1 hour，but it has no signifficance comparing to control group（P=0.933）.At 12～72h，the IL10 level rised to a high level in TG，which was higher than in CG (P＜0.05).Conclusion Tacrine intravenous injection could increased serum protective cytokine IL10 level， but decreased injury cytokines TNFα，IL6 content in laboratory rats with pancreatitis.

　　【Key words】 cholingeric antiinflammatory pathway；cytokine；acute pancreatitis

　　细胞因子在重症急性胰腺炎（SAP）发病中起着重要的作用，抗细胞因子是治疗SAP一个重要的方向。新近研究发现，神经系统和免疫系统之间存在着一定的关系，即胆碱能抗炎系统，神经系统通过胆碱能系统对机体的炎症反应起着调控作用。本研究通过制作急性胰腺炎动物模型，静脉注射胆碱酯酶抑制剂他克林（tacrine），从而观察兴奋胆碱能通路对急性胰腺炎大鼠血清中细胞因子水平影响。

　　材料和方法　　

　　1.实验分组

　　Wistar大鼠108只，由右江民族医学院动物中心提供，重300～350 g，根据实验方法分为假手术组、对照组、他克林组各36只。假手术组行开腹髂内静脉插管术，对照组制作胰腺炎动物模型并行髂内静脉插管，他克林组行胰腺炎模型制作及髂内静脉分离插管并经髂内静脉注射他克林（1.5 mg·kg-1·次-1，每6小时注射一次）。
　　
　　2.试剂和议器

　　大鼠TNFα、IL6、IL10酶联免疫吸附试剂盒由深圳精美公司提供；牛黄胆酸钠由美国SIGMA公司提供；配超低温冰箱等。
　　
　　3.模型制作

　　胰腺炎模型：术前禁食12小时，自由饮水，用氯氨酮腹腔注射麻醉(100 mg/ kg)成功后，剪去腹部毛发，消毒，铺无菌巾。经上腹部正中切口进入腹腔，提起胃、十二指肠，显露出胰腺，确认胆胰管，在其近端和远端均以动脉夹或一号丝线暂时结扎，将带有四号针头的1 ml 注射器沿十二指肠壁浆肌层穿刺距离胆胰管开口0.3～0.4 cm处的胆管，注入4%的硫磺胆酸钠0.1 ml/100 g，以0.2 ml/min 的速度注射毕，停留4 分钟，去除结扎线，指压穿刺点，查无漏胆，逐层关腹。
　　
　　4.细胞因子测定

　　分别在模型制作完成后1 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h取各组大鼠髂内静脉血，取上清液离心15分钟后用酶联免疫吸附法测定血清中TNFα、IL6、IL10含量。

　　5.统计学分析

　　所有数据均以-±s表示，采用SPSS13.0统计软件包，作重复测量方差分析。

　　结果

　　假手术组各细胞因子均处于较低水平，对照组较假手术组各个时段细胞因子水平都明显升高，TNFα和IL6水平在48 h时达到高峰，72 h时均有所降低，而保护性细胞因子IL10呈逐步增高走势，在48～72小时时仍然维持在较高水平。他克林组大鼠，细胞因子TNFα，IL6在1 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h时明显较假手术组升高（P＜0.05），但是其升高幅度与对照组相比较明显降低，具有统计学意义（P＜0.05）。他克林组保护性细胞因子IL10在发病初1小时有升高，但是与对照组相比，没有统计学意义(P=0.933)； 而在12～72 h，IL10升高明显，并逐步达到一定高度，与对照组相比，其升高具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。表1 各组各时段细胞因子浓度变化情况(略)注：S假手术组；C对照组；N他克林组。与S组比较，※P＜0.05，与C组比较，△P＜0.05

　　讨论

　　重症急性胰腺炎（SAP）是临床上常见的急症，病情凶险，虽经多年努力，至今仍有高达20%～30%的病死率，是临床上最棘手急症之一。为了寻求治疗SAP的有效办法， 多年来医学界学者在这一领域已经进行了大量的研究和探索，包括使用特异性的细胞因子拮抗剂和通过血液净化清除过多细胞因子即抗细胞因子治疗，目前已经找到许多细胞因子的特异性抑制物，包括细胞因子的可溶性受体、受体拮抗剂，各种细胞因子特异性抗体和其他一些药物，在实验研究中他们也确实能有效降低某种细胞因子的水平，减轻患者的症状和胰腺损伤，但单一的抗细胞因子治疗对于SAP的疗效并不确切，对于实验动物模型生存率的改善仍存在争议。现代临床对于SAP的治疗仍然处于被动地位，解决SAP的关键，就是调节炎症反应平衡。胆碱能抗炎通路是通过减少损害性细胞因子的释放而起作用的。目前国内外尚无胆碱能抗炎通路在急性胰腺炎治疗作用方面的报告。本研究旨在通过胆碱能抗炎通路在急性胰腺炎大鼠治疗作用研究，寻求一种治疗急性胰腺炎有效手段。
　　
　　他克林是胆碱酯酶抑制剂，静脉应用可以提高胆碱能神经的功能。本研究通过静脉注射他克林实现胆碱能抗炎通路在急性胰腺炎中的抗炎作用研究。研究发现对照组各个时段细胞因子水平都明显升高， TNFα和IL6水平在48 h时达到高峰，72 h时均有所降低，而保护性细胞因子IL10呈逐步增高走势，在48～72 h时仍然维持在较高水平。而静脉注射他克林组动物，细胞因子TNFα，IL6在1 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h时也明显较假手术组升高，但是其升高幅度与对照组相比明显降低（P＜0.05）。他克林组保护性细胞因子IL10在发病初1 h有升高 (P=0.933)。而在12～72 h，IL10升高明显（P＜0.05），并逐步达到一定高度。本研究证实，静脉注射他克林在大鼠实验性急性胰腺炎中，可以有效降低TNFα及IL6等细胞因子的升高幅度，从而减轻细胞因子对机体的损害；保护性细胞因子IL10在应用他克林后，水平较对照组明显升高。

　　他克林是乙酰胆碱酯酶抑制剂，可抑制乙酰胆碱水解，提高脑胆碱能神经元功能。电刺激迷走神经或应用胆碱脂酶抑制药物或乙酰胆碱受体激动剂，可以抑制巨嗜细胞合成TNFα，还有核转录因子NFκb［1～3］。这些炎症始动因子得到抑制，SAP细胞因子瀑布样连锁反应必然减轻或消失。本研究通过静脉注射胆碱酯酶抑制剂他克林，发现能够有效的降低胰腺炎大鼠发病初期各损害性细胞因子浓度，升高保护性细胞因子IL10。本研究首次将胆碱能抗炎通路引进急性胰腺炎的治疗，为急性胰腺炎这一主要由细胞因子介导的全身性疾病的治疗提供了新的途径。应用胆碱能抑制剂可以增强胆碱能神经元功能，在SAP初期能阻断细胞因子的瀑布链样反应，后续的细胞因子将预期减弱，保护性细胞因子IL10水平升高，从而减少细胞因子对全身其他器官系统的损伤作用。

参考文献

　　［1］Andersson J.The inflammatory reflex-introduction［J］.J Intern Med，2005，257(2):122-125.

　　［2］Wang H，Liao H，Ochani M，et al.Cholinergic agonists inhibit HMGB1 release and improve survival in experimental sepsis［J］.Nat Med，2004，10(11):1216-1221.

　　［3］Czura CJ，Friedman SG，Tracey KJ，et al.Neural inhibition of inflammation: the cholinergic anti-inflammatory pathway［J］.J Endotoxin Res，2003，9(6):409-413.