HPV和p16INK4A与宫颈癌的关系研究进展

【摘要】 　　p16INK4A基因决定着细胞周期的正常运转和细胞增殖、分化及凋亡，与人类多种肿瘤的发生发展有关。p16INK4A在大多数原发肿瘤中缺失，但在宫颈癌及其癌前病变中的表达高低不一。高危型人乳头状瘤病毒（highrisk human papilkmavirus，HRHPV）在宫颈癌发生发展过程中起着重要作用。本文对p16、HPV在宫颈癌中的研究进展作一综述。

【关键词】 p16INK4A 人乳头瘤状病毒 宫颈癌 CIN

　　宫颈癌在妇女各种恶性肿瘤中的发病率仅次于乳腺癌，位居第二，同时近几年呈现上升趋势。宫颈癌的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，涉及多个基因的改变而引发细胞增殖失控。大量病因学研究证实宫颈癌的发生与高危型人类乳头状病毒感染有关。HRHPV感染的宫颈癌及癌前病变组织中出现p16INK4A的异常表达，p16INK4A与HPV感染在宫颈癌中的关系，已成为近年来研究的热点。

　　1 HPV的结构、功能及在宫颈肿瘤中的致癌机理

　　HPV是双链环形封闭的小分子DNA病毒，分子量5000KD，直径为55 nm，由72个壳粒构成的20面的衣壳体，无包膜，其基因在全长约8kb，除一段调控序列（Long control region，LCR）外，其余组成8个基因，包括6个早期表达基因（E6、E7、E1、E2、E4、E5）和2个晚期表达基因（L2、L1）。L1基因的DNA序列相对保守，被用作HPV鉴定和分型的依据。至今已有近百种HPV类型被分离确定。根据其致瘤性质，这些感染生殖道的HPV 可分为高危型和低危型。 高危型HPV是指可以引起恶性肿瘤的HPV，如引起宫颈癌的HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV58等，而低危型HPV是指仅引起良性肿瘤的HPV，如引起宫颈湿疣的HPV6、HPV11等。 高危型HPV的E6、E7基因是病毒癌基因。E6可结合多种蛋白，其中最重要的应是结合p53蛋白，并通过与之结合的E6AP蛋白而活化泛素蛋白酶体途径降解p53蛋白［1］，使DNA受损的细胞即不能修复DNA损伤，又不能发生凋亡，只能进行分裂繁殖。多次DNA损伤在细胞内累积，是细胞遗传逐渐不稳定，发生越来越严重的异常重组，最终形成肿瘤。E6蛋白使细胞永生化的另一个途径是增加端粒酶hTERT的活性［2］。E6还可以通过E6AP介导的Blk(src家族酪氨酸激活)蛋白的降解，使细胞1持续分裂。此外，E6还有增强外源DNA整合和细胞基因突变性，使中心粒异常和染色体不稳定，阻断干扰素的产生、结合并降低p16蛋白水平等功能及其它的生化特性。E7蛋白约100个氨基酸，有三个保守区。E7的中心功能就是通过三个保守区域之一与Rb蛋白家族（PRb、P107、P130）结合并通过泛素26S蛋白酶体途径降解PRb家族蛋白［3］，释放E2f蛋白使激活许多相关的DNA合成的蛋白因子，加快DNA复制和细胞的分裂繁殖，促进细胞的转化。E7蛋白结合细胞周期素A和E，及结合细胞周期素依赖蛋白激酶抑制物P21及P27的功能［4］。细胞周期素E活性提高和P21及P27功能下降能增强都能增强细胞周期依赖蛋白激酶的活性，从而使Rb蛋白过磷酸化二释放E2f蛋白，促进细胞周期的进展。此外，E7蛋白还能结合如P48等10多种其它蛋白，可以提高外源性DNA整合的细胞基因突变性，诱导细胞凋亡，抑制cdk抑制蛋白，降解酪氨酸激酶Blk，维持HPV的游离环状结构，是染色体中心粒数目异常并形成非整倍体，激活E2f调节的分裂基因等［4］。综上所述，HRHPV导致宫颈癌是以E6和E7基因表达和蛋白功能的改变为中心，导致遗传基因损伤，最终发展为肿瘤。

　　2 p16INK4A基因结构、功能及在宫颈肿瘤中的异常表达

　　2.1 p16INK4A基因的结构及功能

　　p16INK4A基因又称多重肿瘤抑制基因（MTSI基因）或CDK4I基因，是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的抑癌基因。它定位于人类第9 号染色体短臂( 9p21 ) 上，全长8.5 kb，由3个外显子和2个内含子间隔组成， 2个内含子把p16INK4A的编码序列分为3个区：一个是126 bp的5'区，即外显子1；一个是307 bp的中间区，即外显子2；一个是11 bp的3'区，即外显子3。编码分子量为16569的p16INK4A蛋白，p16INK4A蛋白是细胞周期调节的重要成分，控制细胞的生长和分化，对细胞周期进行负调控，主要是抑制细胞从G1S期转变过程中起关键作用的CDK4/CDK6功能。CyclinD1与CDK4/CDK6结合形成复合物， 能使视网膜母细胞瘤易感基因(即Rb基因， 为一种抑癌基因)的蛋白产物pRb磷酸化， 进而激活某些转录活化因子如E2F (异源双体转录子) ， E2F则能活化DNA合成基因和细胞生长控制基因， 启动DNA合成， 使细胞由G1期进入S期［5］。p16INK4A基因的表达产物P16INK4A可与CDK4和CDK6结合，发挥负性调节作用， 共同完成对细胞增殖周期的调控。

　　2.2 p16INK4A在宫颈肿瘤中的异常表达

　　自Kamb首次报道黑色素瘤p16INK4A基因缺失后，相继又有一些学者在神经胶质瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌等研究中发现p16INK4A表达缺失。宫颈癌中p16INK4A的表达错综复杂。众多的研究表明宫颈癌中p16INK4A呈过表达。研究表明［6］在46例宫颈腺癌中p16INK4A都呈过表达，而在邻近上皮和结缔组织中无表达；在9例宫颈良性病变和5例正常组织中无p16INK4A表达，可见p16INK4A可作为一个分子标志来区分宫颈腺癌和宫颈的良性病变。Braganca等［7］研究了125例宫颈病例，结果显示 99例(79.2%)中p16INK4A呈阳性表达；p16INK4A阳性率在宫颈高级别病变和低级别病变中有显著性差别。显示p16INK4A基因参与宫颈病变的演进过程。显示随着宫颈病变级别的增加，p16INK4A蛋白的表达随之增加，在宫颈癌中呈高表达。可能有以下几种机制；（一）p16INK4A的过表达与HPV感染有关。一方面由于在HRHPV感染的宫颈癌组织中由于HRHPV E7蛋白结合pRb，使其功能失活，解除了pRb对p16INK4A蛋白表达的负反馈抑制，引起p16INK4A过表达［8］；另一方面可能由于在HRHPV感染的宫颈癌组织中，HPV病毒癌基因E6和E7通过整合进入宿主细胞染色体内，分别引起P53、Rb蛋白的功能失调，Rb通路时失控，导致原本不正常的p16INK4A蛋白反馈性高表达，宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱，使其具有永生性的特点而启动一系列癌变过程［9］。（二）近年来的研究发现在宫颈癌发展中p16INK4A基因缺失或突变非常少见［10］ ，p16INK4A基因主要的失活形式是启动子甲基化。徐军等［11］发现在正常组织中p16INK4A无甲基化，在CINⅠCINII/III宫颈癌过程中，p16INK4A基因启动子区甲基化阳性率逐渐升高，认为p16INK4A的过表达可能与p16INK4A基因启动区甲基化有关。Kim等［12］研究发现，在宫颈癌的发生过程中，p16INK4A基因甲基化率和p16INK4A阳性表达率均呈上升趋势，认为在宫颈癌中过表达的p16INK4A是无功能的。（三）p16INK4A过表达可能是经过点突变或蛋白与蛋白之间的相互作用，导致pRb功能缺失，使得RbE2F复合体的合成减少，胞内游离的E2F增多，进而导致cyclinE增多，使癌细胞通过G1/S转换点，进入S期。同时，游离的E2F增多，通过反馈作用使cyclinDCDK复合物表达增高，而后者又反馈刺激p16INK4A， 使其表达量也随之增高［13］。
　　
　　也有少数国内外文献报道p16INK4A基因表达与宫颈癌发生呈负相关。阮永华等［14］发现p16INK4A在正常宫颈，CIN和宫颈癌阳性表达率分别是100%，71.4%，21.6%，且表达有统计学意义，可见p16INK4A的表达在正常宫颈组织CIN宫颈癌呈逐渐下降的趋势。在宫颈腺癌［15］中有同样的报道。Agoff等［16］发现大量的中重度CIN中p16INK4A表达呈阴性，在一定程度上支持了在宫颈癌的发生发展过程中p16INK4A的表达呈下降的趋势，即在宫颈癌中p16INK4A呈低表达。因为并不是所有的宫颈病变都有HRHPV［17］引起，也并不是所有的HRHPV亚型和变异体都引起相同的细胞信号通路失调，或许肿瘤细胞的基因克隆演进过程中p16INK4A发生了丢失［18］。

　　总之，宫颈癌中p16INK4A的表达程度报道不一，p16INK4A蛋白在宫颈癌的发生、发展中所起的作用和作用机制可能与其在其它恶性肿瘤中不同。究其作用如何，即p16INK4A基因在宫颈癌中是否起重要作用，是扮演原癌基因角色或抑癌基因角色，以及作用机制如何，尚需进一步研究。

　　3 在宫颈肿瘤发生发展中p16INK4A与HPV的关系

　　随着 HPV 在宫颈癌病因学中关键性地位的确立，多数学者p16INK4A在高危型 HPV（HRHPV）阳性的宫颈癌和癌前病变中过表达。在宫颈鳞状上皮中，p16INK4A在HRHPV感染导致的宫颈癌及癌前病变中有过表达，而在HPV阴性的宫颈癌和正常组织中无表达。

　　Ekalaksananan等［19］研究186例宫颈病变患者，发现宫颈高级别的病变和SCC中都有p16INK4A的表达和HPV感染，在低级别的病变中二者所占的比例是64%和27%，在ASCUS中是62%和0%，在正常组织中是7.4%和3.4%。可见，p16INK4A的表达与HPV的感染随着宫颈上皮内瘤变得级别进展而增加。国外学者［20］研究在HPV感染的病例中，p16INK4A过表达在LGSIL(低度的鳞状上皮内瘤变)向HGSIL(高度的鳞状上皮内瘤变)组与LGSIL组比较时有显著性意义，在LGSIL组中，p16INK4A的过表达与HPV16或HPV18感染无显著性意义，在LGSIL向HGSIL恶化的组中p16INK4A过表达与HPV16感染有显著性意义，而与HPV18感染无显著性意义，可见p16INK4a可以作为与HPV感染有关的宫颈恶性进展的分子标志。Ishikawa等［21］发现在HRHPV阳性的病例中，32.4%（12/37）CINⅠ，82.1%(32/39)CINⅡ，93.2%(41/44)CINⅢ，和全部的（16/16）SCC中有p16INK4A过表达，在CINI和CINII中p16INK4A过表达率有显著性的不同、可见p16INK4A可作为一个分子标志来区分HPV感染宫颈病变级别高低，辅助临床诊断。在宫颈癌中，宫颈腺癌的发病率约占5%10%，且有逐年递增的趋势，但是宫颈腺癌及原位腺癌在筛查中常常被漏诊。Gioyanni等［22］研究45例病例，发现所有病例都有HRHPV感染，免疫染色显示26例宫颈腺癌p16INK4a呈强阳性表达，4例不典型增生宫颈腺中p16INK4a成灶状表达，反应性病变中p16INK4a呈阴性表达，因此将HRHPV检验和p16INK4A免疫染色作为宫颈癌筛查项目将提高宫颈腺癌的检出率。

　　
　　然而一些研究［23］发现无论HPV感染与否，p16INK4A表达并无异常，在CIN、浸润性鳞癌和腺癌中都有较高表达。并非所有高危 HPV 阳性宫颈癌及其癌前病变中 pl6INK4A均呈高表达，且部分HPV阴性宫颈癌中pl6INK4A也可呈高表达。林贞花等［24］应用PCR方法筛查出HPV感染阴性的20例慢性宫颈炎、20例宫颈上皮内瘤变（CIN）、3例宫颈腺上皮内瘤变（CGIN）、38例浸润性鳞状细胞癌（鳞癌）和15例浸润性腺癌，结果表明p16INK4A蛋白特异性地表达在CIN和CGIN病变、磷癌及腺癌中，而在正常鳞状上皮和腺上皮中没有任何阳性表达。可见在宫颈肿瘤中p16INK4A的表达与HPV的感染无关。Yildiz等［25］发现100%的HSIL和80%的LSIL中，p16INK4A呈阳性表达;其中48.6%的病例中有HPV感染，HRHPV感染占31.4%;经分析HPV感染与p16INK4A的表达无统计学意义即p16INK4A与HPV感染是两个独立的事件。总之，p16INK4A与HPV感染关系尚未确定，有待进一步研究。

　　4 展 望

　　目前，在宫颈癌筛查中所用的各种细胞学和HRHPV检测方法都有一定的局限性。 p16INK4A异常表达和HPV感染与宫颈癌及CIN有密切的关系，并且随着病变加重有呈动态变化，可将二者作为生物学标志物应用于辅助宫颈癌及其癌前病变的筛查和诊断， 其检测方法简单，易于操作，避免了形态学诊断的主观性，有广阔的应用前景，但目前仍存在一些问题，如：在宫颈癌中，p16INK4A基因的表达水平高低不一，其机制到底是什么；p16INK4A的表达与HPV感染的确切关系是什么；调控p16INK4A表达的因素有哪些；这些有待于以后的研究，相信随着人们对p16INK4A和HPV认识的不断深入和技术发展，这些问题都将能得到逐步解决。

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