作者：于波涛 姜云平 张勤 陈冬琴 江宗婷
【摘要】 目的 研究D101大孔树脂对治伤灵口服液中芍药苷的吸附性能及分离纯化的工艺参数。方法 采用HPLC法测定芍药苷含量，通过考察pH值对吸附的影响、吸附容量、洗脱剂选择及其用量等因素对芍药苷分离纯化的影响，确定工艺参数。结果 D101大孔树脂对芍药苷的适宜交换吸附条件为pH=4，最大上柱量以芍药苷计为3.661mg·g-1树脂，水洗除去杂质，洗脱剂为40%乙醇溶液，用量为8个柱体积（BV）。结论 D101大孔树脂能提高芍药苷纯度，为芍药苷含量测定提供保证。
【关键词】 D101大孔树脂 芍药苷 治伤灵口服液 分离
治伤灵口服液是在桃红四物汤的基础上研制而成的复方制剂，主要由川芎、赤芍、桃仁、红花等十二味药材，通过水蒸汽蒸馏法提取挥发油，正交试验优化水提醇沉工艺制备而成的口服液，主要功效为活血化瘀、补肾强骨等，具有显著的降压、抗炎、扩张冠脉血管等作用。近年来大孔树脂吸附技术在中药精制工艺中的应用日益广泛，而D101大孔树脂对皂苷的吸附性能较好，故本研究旨在优化D101大孔树脂对治伤灵口服液中芍药苷的分离纯化工艺，最大限度的分离、纯化出治伤灵口服液中的芍药苷，为治伤灵口服液的含量测定提供最佳分离纯化工艺。
1 仪器和材料
1200型HPLC（美国Agilent公司）；AE200型电子天平（瑞士Mettler公司）；pHS–3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；层析柱（10mm×300mm）；D101型大孔树脂（成都市科龙化工试剂厂，批号：20070118）；芍药苷标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110736-200731）；甲醇为色谱纯；水为重蒸水；95%乙醇（药用，成都市蓉康医疗保健实业有限公司）。
2 方法与结果
2.1 芍药苷的含量测定
2.1.1 供试液的制备 按处方比例称取药材，其中当归、川芎、柴胡等提取挥发油，药渣与剩余药材混合，加水8倍量，煎煮3次，每次1 h，合并滤液，将其浓缩为1.10～1.14 g·ml-1的浸膏，放冷，加入乙醇使醇沉浓度为70%，静置48小时后滤过，滤液回收乙醇，放冷，加入炼制好的蜂蜜，混匀，再缓缓加入挥发油及0.04%对羟基苯甲酸乙酯，加水至全量，调节pH 值，搅拌均匀，即得。
2.1.2 阴性对照溶液的制备 按比例称取除赤芍以外的处方药材，按供试液的制备方法制备。
2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品10mg于100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
2.2.4 色谱条件［1］ 色谱柱：Agilent Zorbax SBC18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相：甲醇水（35∶65），流速：1ml·min-1，检测波长：λ=230 nm，柱温：30℃。
图1 芍药苷色谱图（略）
（A.标准品；B.阴性对照；C.供试品；1.芍药苷）
Fig 1 HPLC chromatogram of paeoniflorin
(A. reference substance；B. negative sample； C.sample； 1. paeoniflorin)
2.2.5 绘制标准曲线 按上述色谱条件，分别进样对照品溶液2、4、8、10、12、16 μl，记录峰面积（Y），以芍药苷的进样量(X，μg)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y =1449.9X+8.2337，相关系数r=0.9999。结果表明，在0.2 μg～1.6 μg范围内芍药苷含量与峰面积成良好线性关系。图1为芍药苷的色谱图。
2.2.6 仪器精密度试验 取对照品溶液10μL，按上述色谱条件连续进样6次，计算芍药苷色谱峰峰面积的RSD为 0. 57%。
2.2.7 稳定性试验 取供试品溶液1ml于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液10μL，分别于0，1， 2， 4， 8 ，12 h进样测定，计算峰面积的RSD值， 芍药苷的RSD为 0.766%。表明样品溶液在12 h内稳定。
2.2.8 最低检测限 将芍药苷对照品溶液稀释进样，以信噪比为3∶1，芍药苷最低检测限为18.54 ng。
2.2.9 回收率试验 采用加样回收率方法，精密量取已知含量样品共9份，定量加入芍药苷对照品，测定含量。结果见表1。
表1 加样回收率试验结果（略）
Tab.1 The recovery test of paeoniflorin
2.3 大孔树脂的预处理 取适量D101大孔吸附树脂，95%的乙醇充分浸泡后并用乙醇多次洗涤，直至上清液于试管中加入适量蒸馏水无白色浑浊为止，再用去离子水洗至无明显乙醇气味即可，最后转入酸碱处理，即用5%的盐酸溶液浸泡3 h，然后用去离子水洗至pH值为中性，接着用5%NaOH溶液浸泡3 h，然后用去离子水洗至pH值为中性即可。
2.4 吸附条件的确定
2.4.1 酸碱对芍药苷稳定性的影响 分别精密量取0.2 mol·L-1NaOH溶液、氨试液、0.2 mol·L-1HCl溶液与芍药苷标准溶液（0.1 mg·ml-1）等量混合，每0.5 h测定一次含量。结果，1 h后，NaOH溶液和氨试液中芍药苷被降解完全，而HCl溶液中芍药苷含量为原来的99.85%，无明显变化。
2.4.2 pH对D101大孔树脂静态吸附芍药苷的影响［2］ 准确称取吸干表面水分的活化处理树脂8份，每份5g，分别置于50 ml锥形瓶中，各加入pH值分别为3、4，5，6，7的供试液14 ml，每个pH值平行操作三份，室温下每隔30min振荡1min，60次/min，1h后过滤，分别吸取滤液1ml于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度。按上述条件测定芍药苷的含量，计算吸附率。结果，不同pH静态吸附芍药苷的吸附率分别为25.57%、40.44%、18.15 %、20.43 %和28.61 %，由此可知，pH为4时，大孔树脂静态交换吸附容量最大。
2.4.3 D101大孔树脂静态吸附容量的确定 准确称取4g吸干表面水分的活化处理树脂3份，分别置于锥形瓶中，加入一定浓度的供试品溶液40ml 供试液，振摇1min（60次/min）后室温静置24 h，分别取药液1ml于10ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，按上述条件测定芍药苷含量，结果表明，D101大孔树脂对芍药苷的静态吸附容量为3.661 mg·g-1。
2.4.4 大孔树脂动态吸附量的测定 称取大孔吸附树脂5.0g，湿法装柱，树脂床体积约为10 ml，取不同浓度的供试液上树脂柱，吸附流速保持2.0 ml·ml-1，用约2BV的蒸馏水洗脱除去水溶性成分和树脂间未吸附的芍药苷，测水洗脱液中芍药苷的浓度，用吸附前后的质量差法计算树脂的动态吸附量，实验结果表明D101型大孔吸附树脂对芍药苷的动态吸附量为1.01 mg·mg-1，约为静态吸附量的1/3倍。
2.4.5 不同洗脱溶剂对芍药苷静态洗脱效率的影响［2］ 准确称取吸干表面水分的活化处理树脂30g，加入30ml供试液浸泡，适时振摇，20 h后，用150ml水分5次洗涤，洗液定容至250ml并进行含量测定。将上述水洗后的树脂用滤纸吸干，精密称取3份，每份5g，分别加入40%乙醇溶液、0.1mol·L-1的HCl溶液和0.1mol·L-1HCl的40%乙醇溶液各6ml，振荡1min，60次/min，静置30min后滤过，收集滤液，重复洗脱5次，分别合并滤液并定容，测定滤液中芍药苷的含量，计算树脂的解吸附率，结果见表2。
表2 树脂在不同溶剂中的洗脱效果（略）
Tab.2 Elution effects of paeoniflorin with different solvents
结果表明，水洗液中未检出芍药苷，在上述三种洗脱溶剂中，乙醇洗脱效果最好，其解吸附率为95.49%，而酸性醇溶液次之，酸性溶液解吸能力最差。
2.4.6 洗脱液浓度的选择 准确称取吸干表面水分的大孔树脂10g 6份，分别装柱，加蒸馏水调整流速为1ml·min-1，并排净柱内的水分，精密量取口服液1ml上柱，5 min后，用50ml水分次洗涤树脂，去除杂质，收集洗脱液进行芍药苷含量测定，各层析柱分别以20%、30%、40%、50%、60%、80%的乙醇溶液各50ml洗脱，收集洗脱液并测定芍药苷的含量，结果见表3。
表3 不同浓度乙醇的洗脱效果（略）
Tab.3 Elution effects of ethanol at different concentrations
结果表明，水溶液对芍药苷无洗脱能力，不同乙醇浓度对芍药苷洗脱能力不同，50%乙醇洗脱芍药苷达到最大值。从表中还可以看出，40%乙醇洗脱芍药苷的解吸附率与50%乙醇的洗脱效果相当，因此，可采用40%乙醇作为洗脱液。
2.4.7 洗脱液用量的选择［3］ 准确称取吸干表面水分的D101大孔树脂10g装柱，加入1ml供试液，平行操作3份，静置5min，以50ml水洗脱，流速为1ml·min-1，收集洗脱液定容至50ml，测定洗脱液中芍药苷的含量。水洗脱后的树脂柱分别加入40%乙醇洗脱，按柱体积收集洗脱液（BV），分别进行含量测定，结果见表4。
表4 不同用量的洗脱剂对洗脱效率的影响（略）
Tab.4 Comparison of extracting efficiency with different eluant volume
结果表明，水洗脱液及40%乙醇6～7.5个柱体积洗脱液中未检出芍药苷，为确保芍药苷洗脱完全，确定以8倍柱体积40%乙醇为洗脱溶媒。
3 讨论
3.1 从酸碱对芍药苷的稳定性影响结果可以看出，芍药苷在酸性溶液中稳定，而在碱性溶液中不稳定。所以未考察碱性条件对D101大孔树脂静态吸附芍药苷的影响。在分离纯化芍药苷时，血府逐瘀口服液标准（YBZ11722004）中采用氨试液去除杂质，但通过实验发现，氨试液在除杂质过程中也会使芍药苷大量降解，而且使用氨试液去除杂质，对芍药苷测定时的色谱峰分离无明显效果。因此，在应用大孔树脂分离纯化芍药苷时还应充分考虑纯化环境的pH值，避免因芍药苷降解所造成分析结果的失真。
3.2 考察树脂的静态解吸附时，水洗液中没有检测出芍药苷，说明用水洗除杂质不会影响芍药苷的含量。酸性乙醇溶液比酸性水溶液的洗脱效果好，但比乙醇溶液效果差，说明酸性环境对芍药苷的洗脱效率有一定的影响。因此，乙醇溶液可作为洗脱芍药苷的最佳洗脱剂。
3.3 考察洗脱剂浓度与效果的关系时，在一定范围内，随着乙醇含量增加，洗脱芍药苷的效率提高，但达到50%以后，洗脱效率未见有明显变化，反而所下降，这可能是因为芍药苷极性较高，较低浓度的乙醇即可将其从大孔树脂上洗脱，过高浓度的乙醇在洗脱芍药苷的同时，极性较低的成分也有可能被洗脱，降低了芍药苷的溶解度所致，此外，由于浓度过高的乙醇洗脱出来的芍药苷中低极性成分较多，含量测定时容易导致拖尾［4］，故采用40%乙醇洗脱较好。
参考文献
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