α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响

【摘要】 目的 检测α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响情况，探讨α硫辛酸对糖尿病大鼠学习与记忆影响的机制。方法 Wistar大鼠共30只，随机分成3组，对照组10只，治疗组10只，糖尿病组10只。糖尿病大鼠模型用链佐菌素(STZ)制模。12周后，Morris水迷宫测试其学习记忆能力， western blotting检测各组NFκB蛋白水平表达， TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡情况。结果 糖尿病组大鼠学习成绩降低(P&<0.05)，TUNEL阳性细胞增多(P&<0.05)，NFκB蛋白水平表达增加(P&<0.05)，α硫辛酸治疗组大鼠较糖尿病组学习成绩升高(P&<0.05)，TUNEL阳性细胞减少(P&<0.05)，NFκB蛋白水平表达减少(P&<0.05)。结论 NFκB蛋白的表达增高可能与糖尿病大鼠海马神经元凋亡及认知功能障碍有关。α硫辛酸可能通过降低NFκB的表达，从而对糖尿病大鼠学习与记忆障碍有一定程度的改善。

【关键词】 α硫辛酸 糖尿病脑病 认知功能 凋亡

糖尿病是当代危害人类健康的三大疾病之一，WHO估计到2025年全世界糖尿病患者可能达到3亿。糖尿病各种慢性并发症是引起糖尿病患者死亡和残疾的主要原因。既往对糖尿病肾脏、心脏等并发症研究较多，而对糖尿病脑病(Diabetic encephalopathy)研究较少，目前糖尿病脑病作为较为一种独特的糖尿病慢性并发症已被医学界公认，并逐渐成为研究热点［1］。有研究显示，糖尿病患者中阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发病率较非糖尿病患者增加2倍以上［2］，糖尿病合并AD的患者脑萎缩程度明显重于单纯AD的患者［1］；因此，糖尿病和AD已经成为医学和社会面临的严峻问题。虽然糖尿病是AD发病的重要危险因素之一，但对其具体的作用机制研究尚少。α硫辛酸（αlipoic acid，αLA）广泛分布于动植物等生物组织中，具有较强的抗氧化作用。有研究认为αLA可以改善糖尿病鼠血糖和氧化应激水平［3］。此外，由于αLA生物组织易吸收利用，并能通过血脑屏障，对很多脑和神经衰退性疾病可能都有一定的防治作用。基于此，本研究以STZ诱导糖尿病大鼠模型，用αLA进行干预，旨在探讨αLA对于β淀粉样蛋白的沉积、海马神经元凋亡及对糖尿病大鼠认知功能障碍的影响，以期初步揭示αLA应用于糖尿病脑病认知功能障碍的治疗机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组及建模方法 清洁级近交系Wistar雄性大鼠30只（由第三军医大学大坪动物实验中心提供）．重约250g，通过随机数字表按余数法分成正常组10只(常规饲料喂养，10只 N组)、糖尿病组10只(STZ，D组)和药物干预组10只（STZ+α硫辛酸，Ⅰ组），正常对照组用基础饲料喂养4周，3ml 0.1mmol/L柠檬酸缓冲液腹腔注射，再喂养12周；大鼠糖尿病模型喂养4周，65mg /kg链尿菌素（STZ）腹腔注射喂养4周后测血糖，血糖16.7mmol/L判断为成模，继续喂养8周［3］；糖尿病成模大鼠20只，随机分为2组：糖尿病组和α硫辛酸治疗组各１0只，成模8周后，α硫辛酸组给予α硫辛酸腹腔注射30mg／(kg.d，溶解于100mM pH 7.4的Tris 缓冲液中)，干预2周；正常对照组和糖尿病组同期给予等量Tris 缓冲液 (pH 7.4)，腹腔注射2周。

　　1.2 组织标本采集和保存 喂养16周后，摘取心脏，锡箔纸包裹后保存于-80℃冰箱； Morris水迷宫检测学习记忆能力，TUNEL检测神经元细胞凋亡情况，western blotting检测NFκB蛋白表达。

　　1.3 Morris水迷宫测试 成模第8周，在直径约150cm的圆形水池中，设置直径约10cm、高15cm的平台，平台表面低于水面2cm，先通过4天的训练让大鼠熟悉并游至平台上。第5天隐藏平台，通过记录分析系统分析处理潜伏期，考察学习能力。第6天撤去平台，进行空间搜索实验——去除平台观察2min内大鼠在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数，测试记忆能力。

　　1.4 western blotting检测 每组取20μL上述各组细胞蛋白和5μl上样缓冲液混合后上样进行聚丙烯凝胶电泳，采用10%的分离胶，5%的积层胶，上样后80V恒压电泳约20min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处，换恒压100V电泳2h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部。半干电转法将分离胶上的蛋白转移到经甲醇处理的PVDF膜上(12V，30min)。膜用1×TBST 溶液配制的5%脱脂奶粉（SIGMA公司）封闭12 h，再加入分别以1/400和1/600稀释的NFκB兔抗鼠抗体（SANTACRUZE，北京中山生物技术有限公司分装，1/400稀释）以及以1/400稀释的兔抗鼠βactin抗体（SANTACRUZE，北京中山生物技术有限公司分装）于4℃孵育过夜，TBST清洗3×10min，加入1/1000HRP标记的羊抗兔IgG抗体（SANTACRUZE公司生产，北京中山生物技术有限公司分装）37℃摇床上以50r/min孵育60 min，TBST清洗3×5min。用化学发光试剂盒（北京中山生物技术有限公司）检测结合的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，X线片显影，用Quality one软件分析，以目的条带光密度/βactin光密度作为表达强度的定量指标。

　　1.5 检测细胞凋亡 将海马组织用PBS洗3次后于4%的多聚甲醛中固定25min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，所用试剂盒为南京凯基生物有限公司提供。将用蛋白酶K消化后的切片用TUNEL液覆盖，37℃下孵育90min；SSC终止反应，抗HRP抗体常温孵育15min，PBS洗净，DAB呈色。光镜下凋亡细胞呈深浅不一的棕黄色。凋亡细胞半定量分析：根据凋亡细胞分布情况在400倍光镜下，每组切片拍摄7个阳性视野，每个视野计数200个凋亡的细胞，以计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。

　　1.6 统计学方法 全部数据采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS11.0统计分析软件进行OneWay ANOVA分析检验，P&<0.05为显著性差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 三组细胞胞核NFκB蛋白表达 糖尿病组较之正常对照组核NFκB蛋白表达增加，有显著性差异(P&<0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组核NFκB蛋白表达减少，有显著性差异(P&<0.05)，见表1。

　　2.2 三组细胞浆TUNEL检测结果 糖尿病组较之正常对照组TUNEL阳性细胞增加，有显著性差异(P&<0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组TUNEL阳性细胞减少，有显著性差异(P&<0.05)，见表1。

　　表1 各组海马神经元凋亡率及NFκB蛋白表达比较（略）

　　a：P&<0.05，与正常对照组比较；b：P&<0.05，与糖尿病组比较

　　2.3 隐藏平台获得实验 糖尿病组较之正常对照组潜伏期增加，有显著性差异(P&<0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组潜伏期缩短，有显著性差异(P&<0.05) （见表2）。

　　2.4 空间搜索实验 糖尿病组较之正常对照组中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数较明显下降(P&<0.05)，α硫辛酸组较糖尿病组明显增加(P&<0.05) （见表2）。

　　表2 各组大鼠空间搜索实验/隐蔽平台搜索实验结果（略）

　　a：P&<0.05，与正常对照组比较；b：P&<0.05，与糖尿病组比较

　　3 讨论
　　
　　目前研究认为，高血糖可能通过蛋白质非酶糖化，AGEs的形成、沉积，氧化应激的增加，PKC、多元醇通路的激活，细胞内外钙离子浓度的变化，呼吸链质子梯度的改变诱导细胞凋亡［4］；体外实验发现，高血糖产生的AGEs可引起糖尿病鼠脑组织中Aβ沉积，Aβ与RAGE相结合可以激活NFκB，刺激巨噬细胞集落刺激因子及IL6的分泌， 导致自由基的产生增多，提示NFκB在神经细胞的炎症反应中发挥重要作用 ［5］，以上可促进糖尿病鼠的神经元退行性改变进程［6］。NFκB属于核因子家族，研究显示其参与了多种基因表达的调节，是介导慢性炎症，氧化应激和细胞分化凋亡的重要中介途径之一［7］。目前很多学者认为2型糖尿病是一种慢性炎症疾病，NFκB的活化在糖尿病及其慢性并发症的发生发展中占有重要的地位［4］。
　　
　　在本实验中，我们发现，糖尿病组NFκB蛋白较之正常组增多(P&<0.05)，TUNEL阳性凋亡神经元细胞较之正常组增多(P&<0.05)，到达中心区域几率和穿越目标区次数有所下降(P&<0.05)，逃避潜伏期延长(P&<0.05)，表明长期糖尿病大鼠存在NFκB表达增高，与海马神经元凋亡增多有关，这可能是导致大鼠认知功能下降的原因；而经过α硫辛酸治疗后，与糖尿病组比较，NFκB蛋白表达下降，凋亡的神经元有所减少(P&<0.05)，到达中心区域几率和穿越目标区次数较糖尿病组有所增加(P&<0.05)，逃避潜伏期延长(P&<0.05)，表明α硫辛酸可能通过降低NFκB表达，改善糖尿病造成的海马神经元凋亡，可能与治疗组大鼠认知能力较糖尿病组有所提高相关。通过以上的实验，我们发现在长期的糖尿病代谢紊乱可导致糖尿病大鼠NFκB表达增多，海马神经元凋亡增多，认知能力下降，可能参与糖尿病脑病的发生发展过程；α硫辛酸可改善糖尿病代谢紊乱对神经元的破坏，降低凋亡率，在一定程度上缓解糖尿病脑病的病理发生发展进程。从理论上看，α硫辛酸这种作用的主要机制正是由于减少代谢紊乱导致的超氧化簇（ROS）的聚集和氧化应激的发生，减低神经元凋亡。
　　
　　LA是丙酮酸脱氢酶的辅助因子，可以转变为二氢硫辛酸，是一种“万能抗氧化剂”。Hager［8］等的研究中发现经过LA治疗一年后，AD患者的认知功能较一年前明显提高；Zhang［9］等发现LA能激活PKB/Akt途径改善Aβ及过氧化氢对小鼠神经元细胞的损伤；还有研究发现，αLA在体外能抑制Aβ蛋白聚集，减少Aβ的形成，也能使已经聚集的Aβ解聚［10］。αLA可激活丙酮酸脱氢酶，并活化磷脂酰肌醇3激酶使胞浆内葡萄糖转运体GLUT1、GLUT3、GLUT4易位至胞膜，促进葡萄糖的转运和利用［11］。因此我们推测αLA还有可能通过改善葡萄糖的代谢降低高血糖对神经细胞损伤作用，有待进一步研究。
　　
　　海马神经元凋亡是AD病理机制的中心环节，因此也是治疗AD的关键靶点。由于αLA能够减少海马神经元凋亡；生物组织易吸收利用，并能通过血脑屏障，其在神经系统退行性疾病中必将发挥重要作用，具有广阔的开发前景。

参考文献

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