作者：刘苹，李平，周元国，雷英
【摘要】 目的 比较低血清浓度(0.4%)和正常血清浓度(10%)培养条件对TGF-β1刺激成纤维细胞增殖的影响。 方法 原代大鼠皮肤成纤维细胞分别采用0.4%和10%血清浓度培养， 加TGF-β1刺激细胞后，分别用BrdU ELISA法检测细胞增殖情况，噻唑蓝(MTT)比色法制作细胞生长曲线。 结果 0.4%和10%血清浓度下，250pg/ml TGF-β1均促进成纤维细胞增殖(P＜0.01)，并促使生长曲线的峰值提前和增加。而25ng/ml TGF-β1均抑制成纤维细胞增殖(Ｐ＜0.05)，并导致生长曲线峰值的滞后和降低。结论 血清浓度对大小剂量TGF-β1刺激成纤维细胞增殖变化无明显影响。
【关键词】 血清；TGF-β1；细胞增殖；MTT法；BrdU ELISA法
ABSTRACT Objective To compare the effects between low-concentrated FBS (Fetal Bovine Serum) (0.4%) and high-concentrated FBS (10%) on fibroblast proliferation induced by TGF-β1 (transforming growth factor beta-1). Methods Primary dermal fibroblasts of rats were cultured by low concentration FBS (0.4%) and high concentration FBS (10%) medium respectively; after TGF-β1 was added， MTT assay was applied to detect the fibroblast proliferation and BrdU ELISA method was applied to made out cell growth currve.Results In both low concentrated FBS (0.4%) and high concentrated FBS (10%) condition， 250pg/ml TGF-β1 promoted cell proliferation (Ｐ＜0.01)， the peak of the cell growth curve appeared earlier and its values increased; 25ng/ml TGF-β1 inhibited cell proliferation (Ｐ＜0.05)， and led to a later appearance of the peak of the cell growth curve and a decrease of its values.Conclusions The FBS concentration has no significant influence on the fibroblast proliferation induced by high or low dose TGF-β1.
KEYWORDS Fetal Bovine Serum transforming growth factor beta-1 cell proliferation MTT assay Brdu ELISA method
皮肤成纤维细胞是重要的修复细胞之一，具有增殖、分泌、分化等多项功能，调控修复过程，参与创面收缩和瘢痕形成等［1］。转化生长因子β1（Transforming growth factor beta， TGF-β1）的生物学效应广泛，它参与了细胞增殖、分化、免疫反应和胞外基质蛋白代谢等的调节。TGF-β1对间充质来源的细胞表现为双向调节作用，即小剂量刺激增殖，大剂量抑制增殖［2，3］。我们实验室以往的研究发现250pg/ml TGF-β1刺激成纤维细胞增殖，而25ng/ml抑制增殖［4］，但当时采用低血清(0.4%)培养条件。为了探讨正常血清浓度对TGF-β1刺激成纤维细胞增殖是否存在影响，我们通过BrdU ELISA法和MTT法对低血清浓度(0.4%)和正常血清浓度(10%)培养条件下TGF-β1刺激成纤维细胞的增殖情况和生长曲线进行了观察。
1 材料和方法
1．1 材料和试剂
健康Wistar 大鼠，雌雄不拘； DMEM培养基（Hycolone，美国）：加入NaHCO3、Hepes、青霉素、链霉素，调pH7.2～7.4；Fetal Bovine Serum（胎牛血清，Sigma，美国）；0.25％胰蛋白酶 (Sigma，美国)； TGF-β-1（Pepro Tech，美国）；MTT (美国Sigma公司)；BrdU ELISA试剂盒(5-溴脱氧尿嘧啶核苷Bromodeoxy uridine，Roch，美国)；多功能荧光读板机(Bio-tak，美国)。
1．2 原代大鼠皮肤成纤维细胞培养和鉴定［5］
采用组织块贴壁法原代培养成纤维细胞，I型胶原抗体免疫组化方法鉴定成纤维细胞， Wistar大鼠麻醉，备皮，酒精消毒备皮部位，取1.5×1.5cm2皮肤， D-Hank’s液洗涤，眼科剪剪碎，以0.5cm间隔贴附于250ml培养瓶壁， 30min后加入含10％FCS的DMEM，置于 CO2孵箱培养。细胞长满后，胰蛋白酶消化传代，取3～5代细胞进行实验。Ⅰ型胶原抗体免疫组化方法鉴定成纤维细胞。400×光镜下观察，阳性结果为胞浆内有棕黄色颗粒。
1．3 BrdU ELISA法检测
0.4%和10%血清浓度下TGF-β1刺激成纤维细胞的增殖情况 ，实验共分0.4%血清-250pg/ml TGF-β1组，0.4%血清-25ng/ml TGF-β1组，0.4%血清对照组，10 %血清-250pg/ml TGF-β1组，10%血清-25ng/ml TGF-β组，10%血清对照组。以细胞数4×103个/孔接种于96孔板，次日加入无血清培养基同步化细胞48小时，再加入0.4%和10%浓度的血清，以及250pg/ml 和25ng/ml TGF-β1。48 小时后用BrdU ELISA试剂盒检测细胞增殖情况。每个实验组4个复孔，重复实验三次。
1．4 MTT法检测
0.4%和10%血清浓度下TGF-β1刺激成纤维细胞的生长曲线，实验分组同上。以细胞数2×103个/孔接种于96孔板，次日加入相应血清浓度的DMEM，再分别加入250pg/ml 和25ng/ml TGF-β1。每3天以相应浓度血清和TGF-β1换液1次。自接种次日至第8日每天取每组4孔细胞进行MTT检测。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标作细胞生长曲线。
1．5 统计分析
所有数据均以平均数±标准误(±SE)表示，采用Microsoft Excel统计软件系统进行分析。每两组之间的资料比较采用双尾Student’s t检验，Ｐ＜0.05为差异显著，Ｐ＜0.01为差异非常显著。
2 结果
2．1 原代皮肤成纤维细胞培养及鉴定
组织块接种3～5天，倒置显微镜下可见有梭形细胞爬行游出，约7～9天，细胞汇合成片，经2次传代后，几乎为纯净的成纤维细胞(图1、A)。免疫组化鉴定细胞Ⅰ型胶原染色为阳性(图1、B)，表明原代培养成纤维细胞成功。
2．2 BrdU ELISA法检测各组的细胞增殖情况
0.4%血清条件下，250pg/ml TGF-β1组较对照组细胞增殖显著，而25ng/mlTGF-β1组较对照组细胞增殖显著减弱（见表1）。10%血清条件下，TGF-β1对成纤维细胞的作用与0.4%血清条件下的作用相似，即小剂量促进增殖，大剂量抑制增殖作用。表1 TGF-β对成纤维细胞增殖影响(略)注：与对照组比较，*Ｐ＜0.05;**Ｐ＜0.01
2．3 MTT法检测各组的生长曲线
由0.4%血清条件下的生长曲线（图2）可见，对照组细胞接种后第2天进入指数增长期，第6天达到峰值进入平台期。250pg/ml TGF-β1组进入指数增长期后较对照组细胞增殖更加明显，第5天即达到峰值，且峰值明显高于对照。25ng/mlTGF-β1组较对照细胞增殖减弱，达到峰值时间延长，峰值明显低于对照。10%血清条件下的生长曲线（图3）可见， TGF-β1刺激成纤维细胞后与对照组比较变化趋势与0.4%血清条件下的生长曲线相似，也表现为小剂量刺激后峰值提前并增高，大剂量刺激后峰值滞后并降低。但10%血清条件下，TGF-β1刺激成纤维细胞后的生长曲线变化幅度较0.4%血清条件有所减弱，提示TGF-β1在0.4%血清条件下的促进和抑制作用更加明显。
3 讨 论
血清是体外组织培养中最常用的天然培养基，它含有丰富的营养物质，对细胞生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。通常在使用合成培养基培养细胞时加入10％血清。但血清成分的复杂性对一些要求较高的基础性研究的结果影响较大，同时它含有的细胞毒性物质和抑制物质对细胞有去分化作用，可能影响某些细胞功能的表达，所以现在很多培养研究都采用无血清或低血清培养条件［6］。例如TGF-β刺激成纤维细胞增殖方面的研究以往文献多采用低血清（0.4%）培养条件［4，7～9］。低血清培养条件避免了血清成分可能产生的不良影响，但同时也造成了促贴壁和扩展因子、粘附因子、结合蛋白等物质的缺失［6］，这势必带来另一方面的不良影响。例如原代成纤维细胞培养时血清中的纤连蛋白(fibronectin，FN)对贴壁和分化起着重要作用，结合蛋白推动新成代谢过程，血清的粘度还可以保护细胞免受机械损伤等［6］。
本实验对低血清浓度(0.4%)和正常血清浓度(10%)培养条件下TGF-β1刺激成纤维细胞的增殖情况进行了比较。结果可见，在0.4%血清条件下，TGF-β1对成纤维细胞的作用表现为小剂量促增殖，大剂量抑制增殖。10%血清条件下，TGF-β1对成纤维细胞的作用趋势基本一致。提示我们血清浓度对TGF-β1刺激成纤维细胞的作用无明显影响。究其原因可能是血清中TGF-β1的含量不足以影响外源TGF-β1的作用。我们进一步对不同浓度血清条件下TGF-β1刺激成纤维细胞的生长曲线进行了比较，他们同样的变化趋势进一步说明了，血清浓度对TGF-β1刺激成纤维细胞的作用没有明显影响。但我们同时也发现，10%血清条件下TGF-β1促进和抑制成纤维细胞增殖的幅度较0.4%血清条件减弱。说明随着血清浓度的增加，外源TGF-β1的作用效果稍有减弱，但血清的浓度无法影响整体的变化趋势。
综上所述，低血清浓度和正常血清浓度培养条件对大小剂量TGF-β1刺激成纤维细胞增殖变化无明显影响。
参考文献
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