超高效纳升液相色谱电喷雾串联质谱鉴定重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白

　　　　 作者：柏兆方 林碧蓉 李萍 李卫华 刘炳玉 王红霞

【摘要】 采用超高效纳升液相色谱电喷雾串联质谱对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白进行了分析。样品经胰蛋白酶酶切后，进行液相色谱串联质谱分析和数据库检索。结果表明， 分别有5个和7个肽段匹配于人肿瘤坏死因子受体和人Ig gamma1 chain C region。比对分析表明，重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白中检测到的人IgG的7个肽段完全与人IgG1的序列匹配，与其它3个亚型只有部分肽段匹配。说明重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白一级结构正确，Fc片段确实为人IgG1的Fc片段。

【关键词】 基因重组受体抗体融合蛋白，纳升液相色谱，电喷雾串联质谱，蛋白鉴定

　　Abstract The Nano ultrahigh performance liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry(UPLCESIMS/MS) was used to characterize the primary structure of recombinant human necrosis factorα receptorⅡ∶IgG Fc fusion protein. Samples were digested by trypsin， followed by liquid chromatographytandem mass spectrometry analysis and database search. Five peptides matched with tumor necrosis factor receptor and seven peptides matched with human IgG1 fragment of the Fc. Further analysis demonstrated that seven peptides all matched with the IgG1 Fc but only partly peptides matched with the other subtypes. RhTNFR:Fc is fused by IgG1 Fc but not other subtypes.

　　Keywords Recombinant human necrosis factorα receptorⅡ∶IgG Fc fusion protein， nano ultrahigh performance liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry， protein identification

　　1 引 言

　　类风湿关节炎(rheumatoida rthritis， RA)是一种以累及关节为主的系统性自身免疫性疾病。近年来研究表明，肿瘤坏死因子a（TNFa）是RA发病机制中的关键因子。阻断TNFa即在RA发病机制的上游阻断了炎症反应，达到治疗RA的目的[1]。注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR：Fc)用于治疗RA，不仅可缓解症状，还可阻止关节变形，临床效果好。该药是由Ⅱ型TNF受体P75的细胞外部分和人免疫球蛋白(IgG)1的Fc段形成的融合蛋白。Ⅱ型TNF受体P75的细胞外部分是与游离肿瘤坏死因子特异结合的部位，竞争性地阻断肿瘤坏死因子和效应细胞表面的肿瘤坏死因子受体结合，阻断肿瘤坏死因子的生物活性，达到减轻炎症的目的[2]。人IgG1的Fc段可延长药物半衰期。

　　基因重组药物需要经过严格的质量控制来确保药效和药物的质量。目前， 基因产物的质量控制主要包括分子量测定、等电点测定、纯度分析、结构分析以及生物活性分析等[3]。结构测定主要是包括蛋白质N端序列分析[4]、C端序列分析、二硫键分析及蛋白质肽谱分析[5，6]。形成了以等电聚焦电泳[7] 、氨基酸组成分析、氨基酸序列分析[8]、生物质谱[9]、细胞学实验及动物实验[10]等为基础的综合鉴定体系。对于高度同源蛋白，如果N端或C端含有不同的氨基酸，则可以通过N端或C端测序来区分。对于重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(商品名益赛普)，这两种方法都不能区分。本实验采用同时具有分离能力和测序功能的超高效纳升液相色谱电喷雾串联质谱（NanoUPLCESIMS/MS）法进行分析，对其进行了准确鉴定。目前，尚未见到准确鉴定融合蛋白中高度同源人IgG的报道。

　　益赛普是我国第一个实现产业化的人源化单克隆抗体药物（生物制剂），已于2005年在国内获得批准上市销售。但是该药品进入国际市场必须确定融合蛋白抗体部分为人IgG1的FC片段。人IgG共有4个亚型，序列高度相同，一般的分析鉴定方法难以区分，因此高效、高分辨的质谱鉴定方法成为首选的鉴定方式。本实验采用NanoUPLCESIMS/MS法对样品酶切溶液进行质谱分析，经肽段序列分析比较，准确鉴定了益赛普的结构组成，证明益赛普中的IgG确实为IgG1，为其出口提供了可靠依据。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　超高效纳升液相色谱电喷雾串联质谱(美国Waters公司)。样品来源：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白（益赛普）由上海中信国健药业有限公司提供。胰蛋白酶为美国罗氏公司测序级的酶；碘乙酰胺（ACROS公司）；DTT（美国ICN公司）；实验用水为MilliQ 纯水器制备的去离子水；其余试剂均为国产分析纯。

　　2.2 样品的还原、烷基化和酶切

　　称取重组蛋白样品2 μg，溶于0.025 mol/L NH4HCO3中制得1 g/L溶液，以0.01 mol/L DTT在56 ℃还原60 min， 以0.055 mol/L碘乙酰胺室温闭光烷基化30 min，然后加入1 μg胰蛋白酶，在37 ℃酶切过夜即可。

　　2.3 酶切肽段的NanoUPLCESIMS/MS分析

　　取2 μL 酶切产物，加3 μL 1%甲酸溶液酸化，然后进样2 μL用NanoUPLCESIMS/MS分析。Symmetry C18(20 mm×180 μm， 5 μm)为富集柱；NanoACQUITY UPLC 超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱为BEH C18（250 mm×75 μm， 1.7 μm）为分析柱。柱温度：35 ℃；流速：200 nL/min；流动相A：含0.1%甲酸的水溶液； 流动相B：含0.1%甲酸的乙氰。梯度：0～80 min，B从1%上升到40%；80～90 min，B从40%上升至80%；90～100 min，80% B停留10 min；100～105 min，B从80%降至1%；105～120 min，1% B平衡15 min。质谱条件：离子化方式：纳升电喷雾正离子；数据采集模式：DDA方式，每次扫描中两个强度最高的离子进行串联质谱分析；毛细管电压：2500 V；锥孔电压：35 V； 源温：90 ℃，采集范围：MS， 350～1600，MS/MS， 50～2000。数据分析软件：PLGS V2.3处理后通过Mascot检索软件的MS/ MS 离子方式检索数据库。检索条件：Trypsin 酶切，M氧化和碘乙酰胺烷基化为可变修饰，漏切位点为1。 MS和 MS/MS的质量误差均为0.2 Da。

　　3 结果与讨论

　　3．1 数据库检索结果

　　酶切后的益赛普样品采用ＮanoUPLCESIMS/MS分析后，经数据库检索鉴定到2个蛋白，其中一个是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor），有5个肽段相匹配，Mascot得分563；另一个是人Ig gamma1 chain C region，有7个肽段相匹配，Mascot得分382（Mascot得分37即为鉴定有意义），说明该样品确实由肿瘤坏死因子受体和人IgG Fc片段两个蛋白融合而成。表1为检测到的人IgG Fc片段7个肽段的质量数、测量误差及氨基酸序列信息。图解1为人Ig gamma1 Fc片段上的氨基酸序列及所检测到的7个匹配位置（加粗斜体标示）。如表1所示，所有肽段的测量误差均小于0.01 Da，说明鉴定准确可靠。表1 益赛普 IgG Fc片段中检测到的7个肽段的氨基酸序列及相关信息（略）

　　3.2 检测结果与IgG四亚型比较

　　人IgG共有4个亚型，4个亚型序列高度同源，NCBI登陆号分别为IgG1，CAC20454；IgG2，CAC20455；IgG3，CAA67886；IgG4，CAC20457。为进一步确认益赛普中IgG确实为IgG1，将从益赛普中检测到的7个肽段和IgG的 4个亚型的序列进行了比对分析，结果见表2。在益赛普中检测到的7个肽段均与IgG1 Fc片段相匹配，只有1个可与IgG2 Fc片段相匹配，5个与IgG3相匹配，1个与IgG4相匹配。其中有2个肽段为IgG1 Fc片段所特有的肽段，这2个肽段的串联质谱测序图见图1和图2。从图1和图2可见，强度高的峰得到了很好的匹配，这也说明本方法的测序效果是非常好的。同时进一步证明了重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白中的Fc片段确实为人IgG1的Fc片段。表2 益赛普中检测到的7个肽段和4个人IgGs Fc片段预测肽段的比较（略）

　　生物质谱，尤其是电喷雾串联质谱的应用，为蛋白及多肽的测序开辟了一条新的途径，成为鉴定微量蛋白和蛋白修饰的有力工具[11]。NanoUPLCESIMS/MS方法具有分离能力强、测序效果好和灵敏度高等优点，已成为研究蛋白质最强大的工具 [12]，在蛋白质的翻译后修饰研究和同源蛋白的区分方面也显示出独特的优势，在重组蛋白药物的质量控制方面也将发挥重要作用。

参考文献

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