固定丝素蛋白膜中的联吡啶钌电化学发光行为的研究与应用

　　　　 作者：李利军 蔡卓 蓝苏梅 吴启涛 程龙军 郝学超

【摘要】 　　基于苯海拉明对联吡啶钌(Ru(bpy)2+3)的电化学发光的增敏作用和丝素蛋白联吡啶钌复合膜修饰玻碳电极稳定好的特点，建立了一种以丝素蛋白多孔膜联吡啶钌复合物修饰的玻碳电极电化学发光检测苯海拉明的新方法。结果表明，该修饰电极具有很好的电化学活性和电化学发光(ECL)响应。在最佳实验条件下，苯海拉明浓度在1.0×10－4～1.0×10－7 mol/L范围内与其相对发光强度呈良好的线性关系(r=0.9989)； 检出限为2.3×10－7 mol/L（S/N=3）。连续平行测定3.78×10－5 mol/L苯海拉明5次，发光强度的RSD为1.76%。 用于实际样品中苯海拉明的测定，结果满意。

【关键词】 苯海拉明；电致化学发光； 联吡啶钌；丝素蛋白；化学修饰电极

　　Abstract Based on the increasing effect of diphenhydramine on Ru(bpy)32+ electrochemiluminescence (ECL) system， an ECL method was developed for the determination of diphenhydramine hydrochloride by silk fibroin (SF)Ru(bpy)2+３ composite film modified glassycarbon electrode. A highlysensitive sensor was prepared based on SFRu(bpy)2+３ composite film modified glasscarbon electrode. Its fabrication procedure， related experiment conditions and electrochemical characterization were studied. Under the optimum experimental condition， the linearity of diphenhydramine concentration to ECL intensity was achieved (r2=0.9989) in the concentration of diphenhydramine hydrochloride of 1.0×10－4－1.0×10－7 mol/L and the detection limit (S/N=3) was 2.3×10－7 mol/L. The RSD for 5 times determination of 3.78×10－5 mol/L diphenhydramine was 1.76%.
Keywords Diphenhydramine; Electrochemiluminescence; Tris(2，2′bipyridine)ruthenium; Silk fibroin; Modified electrode

　　1 引 言

　　盐酸苯海拉明(Diphenhydramine hydmchloride，DPH)化学名为N，N二甲基2(二苯基甲氧基)乙胺盐酸盐，又名苯那君，是一种氨基醚类衍生物，为常用的抗组胺药物。具有抗过敏、止痒、消炎、消肿、镇静及镇吐等作用，临床主要用于荨麻疹、枯草热、过敏性鼻炎和皮肤瘙痒等皮肤黏膜变态性疾病。目前，对DPH的测定方法主要有原子吸收法[1]、疏水作用电动色谱法[2]、分光光度法[3]、离子选择电极法[4]、流动注射分光光度法[5]﹑气相色谱法[6，7]及电化学法[4]等，分别用于片剂[1，3，4，7]、药膏[2]、胶囊[5]和糖浆[5，7]中DPH的测定。虽然这些方法均可直接或间接测定1×10－5～1×10－3 g/L的DPH，但仍不能完全满足临床痕量分析的要求。而且这些方法多存在操作繁琐或设备昂贵、费时等缺点。中国药典2005版采用容量法测定苯海拉明[8]，此方法操作繁琐，终点不易观察，且仅适用于常量分析。因此，开发简便灵敏测定DPH的方法具有重要意义。
　　
　　丝素蛋白(Silk fibroin，SF)是从蚕丝中提取的一种优良的天然高分子材料， SF具有无毒性、无刺激性、无过敏性和良好的生物相容性[9，10]，再生SF已被用于伤口保护、细胞培养、生化酶固定、隐形眼镜镜片和药物释放器等方面[11]。用溶解丝素制备的丝素膜在现代科学领域中具有广泛的应用，如人工皮肤材料、药物控制释放载体、固定酶载体、生物传感器等[12～14]。实验证实，SF可以对多种细胞表现较好的粘附和增殖，具有良好的细胞相容性，并可以通过共混、接枝、交联等方式提高或改变SF的理化性能[15，16] 。

　　联吡啶钌是目前应用范围最广和研究最活跃的电化学发光体系［１７，18］。本实验是以SF作为模板，利用SF与Ru(bpy)2+3相互作用，反应形成新的物质或相互吸附得到的混合物膜，从而制备了新型传感器，实现了Ru(bpy)2+3的固定。实验结果表明，此修饰电极对联吡啶钌具有很好的电化学和电化学发光特性。

　　目前，关于用电化学发光测定DPH的报道较少。以SF固定联吡啶钌构建电化学发光传感器尚未见报道。本研究用SF膜固定联吡啶钌修饰玻碳电极，建立了测定DPH的电化学发光新方法， 实现联吡啶钌的循环使用，并成功地应用于药片中DPH含量的测定。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　MPIE型电致化学发光分析系统(西安瑞迈电子科技有限公司)；DL60D型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；微量移液器（德国Eppendorf公司）。三电极系统: SF膜修饰玻碳电极为工作电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极（饱和KCl溶液）。

　　0.1 mmol/L苯海拉明标准储备液(用时现配)：准确称取0.0029 g 苯海拉明，用水溶解后，转移至100 mL棕色容量瓶中，用水定容，超声脱气后冷藏于冰箱中备用。1.0 mmol/L联吡啶钌(Aldrich公司)储备液：准确称取六水合三（2.2联吡啶）氯化钌0.0374 g， 用水溶解后，转移至50 mL棕色容量瓶中，用水定容，用超声波除气后放入冰箱中（4 ℃）冷藏； 家蚕废丝（汰头， 柳州市汇利丰茧丝有限责任公司）； 0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 7.5）。实验用水均为二次石英亚沸水。

　　2.2 电化学发光传感器的制备

　　2.2.1玻碳电极的预处理

　　将玻碳电极分别用金相砂纸打磨， A12O3粉抛光至镜面，用大量水冲洗后，依次用无水乙醇、丙酮、水超声波清洗，将其置于0.10 mol/L PBS（pH 7.5）中CV扫描，得到稳定的CV曲线为止，室温晾干待用。

　　2.2.2 再生丝素液的配制

　　将废蚕丝先用40 ℃温水浸泡30 min，再浸渍于煮沸的0.5% Na2CO3中脱胶[12]1.5 h， 蚕丝与NaCO3溶液比为1∶30（w／Ｖ)， 然后取出洗净、干燥，并用苦味酸胭脂红指示剂检验脱胶是否完全。用40% CaCl2溶液煮沸搅拌直至溶解，溶液为黄棕色。将溶解的丝素置于截留范围8000～14000 Da的34 mm透析袋中，分别以自来水、蒸馏水流动透析2 d，直至透析液电导率＜1×10－5 Ω－1， 可认为丝素液中的小分子已处理掉，即得再生丝素液。

　　2.2.3 SFRu(bpy)2+3膜修饰玻碳电极的制备

　　取上述再生丝素液80 μL，与100 μL 0.1 mmol/L联吡啶钌混合反应，即可得到SFRu(bpy)2+3复合物溶液。然后将6μL SFRu(bpy)2+3复合物溶液均匀涂在处理好的玻碳电极表面，在室温下自然干燥24 h后，放入0.10 mol/L PBS（pH 7.5）中CV扫描。电极再用水冲洗3次，用氮气吹干后，于室温下干燥保存。

　　2.3 实验方法

　　实验在MPIE型电致化学发光工作站上进行。采用三电极系统。将0.2 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液溶液（支持电解质）加入电解池，采用CV（0.2～1.3 V）扫描，然后记录发光信号，作为空白。在上述溶液中加入一定浓度的DPH溶液0.12 mL， 采用相同的方法测定发光信号值，得相对化学发光强度（扣除空白信号）。绘制相对峰高强度与DPH浓度的校准曲线，同时对样品进行分析测定。
　　
　　发光强度时间曲线由MPIE型电致化学发光工作站给出。电化学发光（ECL）检测池的结构如图1所示。位于检测池下方的光电倍增管用于收集待测样品的ECL强度，光电倍增管负高压为800 V。溶液测定前用超声波除气5 min。 实验在室温下进行，所有电位值均相对于参比电极Ag/AgCl。
　　
　　3 结果与讨论

　　3.1 SF Ru(bpy)2+3修饰玻碳电极中联吡啶钌电化学行为研究
　　
　　考察了SFRu(bpy)2+3/GC/CME的电化学行为。实验发现，固定于SF膜中的联吡啶钌分子仍具有良好的电活性。图2a为CME在0.1 mol/L PBS中的CV图，图2b为该电极在0.1 mmol/L DPH0.1 mol/L PBS中的CV图。由图2可见，固定于SF膜中的联吡啶钌分子仍具有良好的电活性，具有明显的氧化峰和还原峰。

　　3.2 盐酸苯海拉明在SF Ru(bpy)2+3修饰玻碳电极上的电化学发光行为研究

　　DPH在SFRu(bpy)2+3/GC/CME中联吡啶钌电化学发光行为如图3所示。曲线a为该修饰电极在0.1 mol/L PBS中的电化学发光图；曲线b为该修饰电极在0.1 mmol/L DPH0.1 mol/L PBS中的电化学发光图。从图3b观察到发光信号明显增强，从1.0 V开始出现发光信号，到1.12 V达到最大值，这与图2a中固定的联吡啶钌在1.12 V氧化峰电流达到最大值相符，也说明SFRu(bpy)2+3/GC/CME对DPH具有很好的ECL响应。

　　3.3 SF修饰量的选择

　　SF在玻碳电极表面的修饰量对联吡啶钌氧化峰电流和ECL强度都会产生影响。实验考察了修饰量（V）在2～8 μL之间对ECL行为的影响。随着覆盖量增加，联吡啶钌ECL强度增加。当修饰量为6 μL时， ECL强度达到最大值；继续增加修饰量，联吡啶钌氧化峰电流和ECL强度反而稍微降低（图4）。因为随着修饰量的增多，膜厚度也不断增大，电子在膜中阻力变大。本实验中SF修饰量选择6 μL。

　　3.4 缓冲溶液及pH值对发光行为的影响

　　介质是影响电化学发光重要因素。本实验考察了硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、碳酸盐缓冲液对SF膜修饰玻碳电极电化学发光信号强度和电化学发光信号稳定性的影响。结果表明，以PBS为介质时，DPH增敏的联吡啶钌电化学发光信号与其空白电化学发光信号的信噪比最大，且重现性较好，其最佳浓度为0.1 mol/L。考察了pH 6.0～9.0的PBS（图5），在pH=6.0时，发光强度较弱；随着pH值增大，发光强度逐渐增大，当pH=7.50时达到最大值。由于DPH带有胺基，其氨原子上有一对孤电子，易与质子结合，因此在酸性溶液中会与H+反应形成正离子。pH值继续变大， 发光强度有所降低，可能是由于溶液中过多的OH－参与在电极上的竞争反应造成高价态联吡啶钌的减少。实验中选择PBS缓冲液（pH=7.5）。

　　3.5 方法的评价

　　在选定的最佳条件下，通过电致化学发光工作站记录不同浓度DPH标准溶液在SF Ru(bpy)2+3/GC/CME上的发光强度响应曲线，DPH浓度在1.0×10－4～1.0×10－7mol/L与其相对峰高呈线性关系，其线性回归方程为I(counts )=5×107C+1003(r=0.9989)。方法的检出限为2.3×10－7 mol/L（S/N=3）。
　　
　　在含有3.78×10－5 mol/L DPH溶液中，考察了常见的药物赋形剂、无机离子以及有机化合物对方法的影响（＜±5%）。结果表明：1000倍的Na+， K+， NH＋4， Ca2+， Mg2+， NO－3， CO２－3； 300倍的淀粉均不产生干扰； 5倍的半胱氨酸和尿酸产生干扰。

　　固定有联吡啶钌的SF复合物膜修饰的玻碳电极有较好的稳定性和重现性。使用前放置在PBS缓冲液中进行活化，对3.78×10－5mol/L DPH连续平行测定10次，发光强度的RSD为1.76 %，说明该传感器有很好的重现性。将修饰电极放置20 d后，在同样的条件下对同样浓度的DPH 连续测定10次，发光强度如图6所示，说明该传感器具有很好的稳定性。实验观察到修饰电极放置一段时间后对同样浓度DPH响应强度并没有降低，说明SF作为修饰材料固定联吡啶钌中的发光试剂流失现象不严重。

　　3.6 样品分析

　　取10片DPH缓释片研磨粉碎混匀，后称取相当于1片DPH含量的样品量，加水溶解后过滤，滤液定容至100 mL后收藏于棕色容量瓶中，稀释后以确定的最佳实验条件进行测定，结果如表1。

　　在一系列样品中加入标准液进行回收率实验， 测得回收率见表1。结果表明： 回收率为92.7%～101.2%，可见本方法可以用于DPH含量测定。表1 样品测定及回收率实验（略）

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