二维毛细管电泳电化学检测尿样中的β阻断剂

【摘要】 设计并制作了在柱电化学(EC)检测池，用于在同一根毛细管中进行中心切割二维毛细管电泳(2DCE)在线纯化分离检测尿样中的6种β阻断剂。尿样先在15 mmol/L NaAc缓冲液中进行毛细管区带电泳(CZE)分离，带正电荷的β阻断剂与中性和带负电荷的干扰物质分成不同区带，然后在检测端施加13.8 kPa压力将干扰成分从毛细管入口端排出，同时将目标组分驱送到毛细管入口端，最后在90 mmol/L NaAc30 mmol/L SDS缓冲液中进行胶束电动毛细管色谱(MEKC)分离。场放大样品堆积(FASS)/胶束推扫在柱双重富集技术不仅有效抵消压力驱送过程中产生的区带扩散，还可进一步压缩样品区带，提高检测灵敏度。本方法成功用于服药后鼠尿样品中6种β阻断剂的分离测定，经第一维CZE分离排除干扰后，在未涂层毛细管柱(60 cm ×50 μm i.d.)、90 mmol/L NaAc/HAc30 mmol/L SDS运行缓冲液、检测电位0.8 V、运行电压10 kV条件下，对6种β阻断剂进行在线富集分离，峰高、峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为2.0%～4.1%， 1.4%～3.7%和0.9%～2.7%(n=6)。本研究为毛细管电泳在复杂样品在线纯化分析等方面的应用提供了新方法。

【关键词】 二维毛细管电泳; 中心切割; 电化学检测; β阻断剂

　1 引 言

　　二维毛细管电泳(2DCE)是将分离机理不同而又互相独立的两个毛细管电泳分离模式以串联方式结合。Schoenherr等[1]制作了十字交叉型接口用于2DCE分离蛋白质及其水解物; Mohan等[2]用微透析接口连接毛细管等电聚焦(cIEF)瞬间等速电泳/CZE分离蛋白质混合物; Zhang等[3]用微注射器连接cIEF和毛细管电色谱分离蛋白质、肽及血浆样品; 文献[4～7]制作了聚砜中空纤维膜接口和蚀刻多孔膜接口，用于cIEFCZE[4，7]、cIEF毛细管凝胶电泳[5]和cIEF毛细管筛分电泳[6]分离蛋白质混合物。以上报道的2DCE均存二维切换接口处损失部分待测物[1]、第一维分离区带在接口处扩散[2～6]等缺陷。Cottet等[8]研究了在一根毛细管中进行2DCE分离，样品进行第一维分离后，用压力将感兴趣的组分驱送到毛细管入口端进行第二维分离，但在压力驱送过程中存在严重的区带扩散。为减小扩散，将毛细管内径减小到5 μm [9]，但进样量非常小，只能采用高灵敏检测器，导致分离检测体系复杂化。

　　本研究制作了在柱EC检测池，用于在同一根毛细管中进行中心切割2DCE分离在柱EC检测尿样中的6种β阻断剂，并在第二维分离前采用FASS/胶束推扫双重富集技术压缩样品区带，不仅抵消了压力驱送过程中的区带扩散，还可使灵敏度提高4倍。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　MPIA型毛细管电泳仪(西安瑞迈分析仪器有限公司);石英毛细管(60 cm ×50 μm i.d.，河北永年瑞沣色谱器件公司)。β阻断剂：盐酸烯丙洛尔、盐酸拉贝洛尔、马来酸噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿替洛尔、纳多洛尔均为市售药物(青岛医保城)。十二烷基硫酸钠(SDS)、冰醋酸、无水醋酸钠和乙腈(分析纯，上海化学试剂公司)。6种β阻断剂药物分别用水/乙腈(1∶1，V/V)溶解，用0.22 μm滤膜抽滤后，分别配成1.00 g/L的储备液，避光冷藏。实验用水为二次蒸馏水。

　　2.2 样品处理

　　取大鼠2只，收集空白尿样5 mL。6种药物均按30 μg/g的剂量给药， 2 h后收集5 mL尿样， 加入1 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋混合2 min， 以4000 r/min离心10 min，过滤，冰箱保存，备用。

　　2.3 CEEC在柱检测装置

　　为进行在柱EC检测，

参考文献

[10]制作了蚀刻场隔离接头。距毛细管出口端1.5 cm处，用刀将毛细管一侧的聚酰亚胺涂层刮掉5 mm，去掉涂层的部分毛细管放置在40% HF溶液中蚀刻3 h形成一段多孔膜，在该处均匀涂敷一层醋酸纤维素浆，待凝固后，即形成只通过电流而无溶液泄漏的场隔离接头。其检测装置如图1所示。 图1 中心切割二维毛细管电泳在柱电化学检测装置

　　Fig.1 Schematic diagram of heartcutting two dimensional capillary electrophoresis(2DCE) on column EC detectionΦ 20 μm Pt工作电极从毛细管出口端插入0.5 cm，与场隔离接头和分离毛细管呈直线。工作电极、Pt辅助电极、Ag/AgCl参比电极分别从3个不同位置插入聚四氟乙烯(PTFE)检测池中，将检测池置于PTFE密封池，并插入N2管。场隔离接头固定在缓冲液池中，并在池中插入Pt电极作为电泳接地电极。

　　2.4 实验方法

　　毛细管在使用前依次用1 mol/L HCl(5 min)、h3O(2 min)、1 mol/L NaOH(15 min)、h3O(2 min)和CZE缓冲溶液(10 min)冲洗。两次测定间用CZE缓冲液冲洗6 min。

　　首先以10 kV电动进样10 s，鼠尿样品在10 kV下进行CZE分离。当工作电极检测到β阻断剂，立即停止电压。检测端换为MEKC缓冲液，并在检测端施加13.8 kPa的N2压力，290 s时停止N2压力;进样端换为MEKC缓冲液，β阻断剂在10 kV下进行MEKC分离。

　　3 结果与讨论

　　3.1 检测电位的选择

　　考察了6种β阻断剂在Pt电极上的电化学行为。其CV实验表明，6种分析物在0.6～1.0 V被氧化。在0.6～0.8 V时，6种分析物的峰电流均随电极电位的增大而增高。当电位&>0.8 V时，基线噪音开始急剧增大，在0.8 V时信噪比最大。所以，检测电位选择为0.8 V。

　　3.2 MEKC分离缓冲液的选择

　　考察了不同浓度和pH值的Nah3PO4H3PO4， NaAcHAc， NaHC2O4h3C2O4等缓冲体系。结果表明，当缓冲液为90 mmol/L NaAcHAc(pH 4.3)时，各组分的分离度和分离效率最高。由于6种β阻断剂结构相似，电泳淌度相近，在缓冲液中加入SDS胶束可提高分离度。实验得知，SDS浓度在5～20 mmol/L时，样品达不到基线分离; 图2 分离电压对基线噪音(曲线a)和烯丙洛尔分离效率(曲线b)的影响

　　Fig.2 Effect of separation voltage on noise (curve a) and separation efficiency of alprenolol (curve b).当SDS浓度增大到30 mmol/L时，6种组分可以实现完全分离;继续增大SDS的浓度，分离度增大，但基线噪音增大，分离效率下降。因此，缓冲液选择90 mmol/L NaAcHAc+30 mmol/L SDS。

　　3.3 分离电压的选择

　　为防止中心切割2DCE分离过程中分析物在检测池中损失，将检测电极插入毛细管末端进行在柱EC检测。尽管制作了场隔离接头，背景噪音值还会受分离电流的影响。对固定毛细管和缓冲溶液，分离电流只与分离电压有关。如图2所示，当分离电压&<10 kV时，背景噪音很小(曲线a)，分离效率提高(曲线b);当分离电压&>10 kV时，背景噪音迅速增大，分离效率降低。当分离电压&>10 kV时，由于电流产生的焦耳热增大使分离效率减小。因此，分离电压选择为10 kV。

　　3.4 MEKC分离尿样中β阻断剂

　　在上述最佳条件下，6种β阻断剂得到完全分离，如图3a所示。在相同条件下测定了空白鼠尿(图3c)和服药后鼠尿样品中的β阻断剂(图3b)，从图3可以看出，鼠尿样品中大量共存组分在MEKC条件下干扰β阻断剂的测定，经加标判断，部分干扰物质为尿酸、抗坏血酸、氨基酸等。

　　a. 6种β阻断剂标准混合液(Six βblockers standard mixture)： 5 mg/L;b. 服药后鼠尿样品(Postdosing mouse urine); c. 空白鼠尿样品(Blank mouse urine)。条件(Conditions)：进样(Injection)，10 kV×10 s; 90 mmol/L NaAc/30 mmol/L SDS (pH 4.3);分离电压(Separation voltage)： 10 kV; 检测电位(Detection potential)：0.8 V。峰(Peak)：1. 噻吗洛尔(Timolol); 2. 吲哚洛尔(Pindolol); 3. 烯丙洛尔(Alprenolol); 4. 拉贝洛尔(Labetalol); 5. 阿替洛尔(Atendol); 6. 纳多洛尔(Nadolol)。3.5 中心切割2DCE在线纯化分离尿样中β阻断剂

　　6种β阻断剂都是弱碱性化合物，pKa=8.7～9.7，在pH 4.3的NaAcHAc缓冲液中带正电荷，电泳淌度与电渗流方向一致，在CZE条件下迁移较快，而部分干扰成分在该条件下为中性或阴离子化合物， 图4 CZE分离鼠尿样品中β阻断剂的电泳谱图

　　缓冲溶液(Buffer)，90 mmol/L NaAcHAc(pH 4.3)。其它条件及峰号同图3(Other conditions and peak numbers are the same as in Fig.3)。迁移较慢。如图4所示，在 90 mmol/L NaAcHAc(pH 4.3)缓冲液中，6种β阻断剂与干扰成分得到分离。

　　基于上述实验，设计了中心切割2DCE在线纯化分离EC在柱检测鼠尿中的β阻断剂，通过第一维CZE分离将待测物与干扰成分分离，并将干扰物质排出毛细管，然后在MEKC条件下分离6种β阻断剂。具体如下：毛细管内首先充满CZE 90 mmol/L NaAcHAc缓冲液，然后10 kV电动进样10 s，鼠尿样品在10 kV下进行CZE分离。当工作电极检测到β阻断剂的信号，立即停止分离电压;检测端换为MEKC 90 mmol/L NaAcHAc30 mmol/L SDS缓冲液，并在检测端施加13.8 kPa N2压力，溶液以0.2 cm/s的速度流向进样端，干扰物质从进样端排出毛细管，根据毛细管有效长度(59.5cm)和液流速度(0.2 cm/s)可知，β阻断剂在298 s时到达进样端，同时MEKC缓冲溶液进入毛细管中，为防止待测物在进样端损失，290 s时停止N2压力;进样端换成MEKC缓冲溶液，β阻断剂在10 kV下进行MEKC分离。整个过程的电泳谱图如图5a所示，经过第一维CZE分离纯化后，第二维MEKC分离待测物时无干扰峰。

　　在同一根毛细管中进行2DCE克服了常规2DCE制作毛细管接口的困难，消除了死体积。然而，在用N2压将待测组分驱送到进样端时，区带展宽较严重，分离效率较低(图5b)，这与文献[8]的结论一致。为克服区带展宽，提高分离效率，将第一维CZE分离NaAcHAc缓冲液浓度由90 mmol/L降到15 mmol/L，pH值维持不变。实验表明，待测组分与干扰组分仍能得到很好的分离，但迁移时间缩短。第一维分离结束后，待测组分处于15 mmol/L NaAcHAc缓冲液中，离子强度远低于第二维背景缓冲液(90 mmol/L NaAcHAc30 mmol/L SDS)，在缓冲液界面处进行FASS的同时被迎面而来的SDS胶束捕获，使样品区带得到双重压缩。图5c为采用FASS/胶束推扫双重富集技术压缩样品区带后的电泳谱图。比较图5b和图5c可知，采用双重富集技术不仅有效抵消了压力驱送引起的区带扩散，还使灵敏度提高4倍，分离效率达2.9×104～6.3×104。

　　3.6 方法的分析性能

　　在最佳条件下，6种β阻断剂的线性范围、线性方程、检出限和分离效率如表1所示。为验证方法的可靠性，对尿样进行回收率实验，在尿样中加入适量标准储备液，在最佳条件下测定，根据线性方程，计算得到待测物的浓度(表2)。结果表明，回收率在92.0%～103.5%之间，方法准确，可用于实际样品的测定。

　　图5 中心切割2DCE在线纯化分离鼠尿中的β阻断剂

　　Fig.5 Heartcutting 2DCE for online purification and separation of βantagonists in mouse urine

　　a: 第一维至第一个峰被检出、压力驱送过程和第二维分离(First dimension was carried out until the first peak was detected，then mobilization step and the second dimension were carried out)。b: MEKC 过程谱图的放大图(Enlarged electropherogram of MEKC process)。c: 鼠尿样品经中心切割2D CE 中采用FASS和推扫双重富集(Mouse urine was heartcutting， sweeping and dual concentration)。 缓冲溶液(Buffers)：第一维(First dimension) 15 mmol/L NaAc; 第二维(Second dimension) 90 mmol/L NaAc30 mmol/L SDS。表1 方法的特征参数表2 6种β阻断剂的回收率

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