超声波辅助UreaFree试剂结合热变性快速酶解蛋白质

　　　　作者：李雅萍 李友元 周新文 陈长华 张嗣良 杨芃原

【摘要】 建立了一个超声功率超声时间的安全区域，在此范围内进行超声波辅助酶解时，能避免超声波随机断裂蛋白质;在此安全区域内采用响应面法获得最佳超声功率和超声时间。建立了超声波辅助UreaFree试剂结合热变性快速酶解蛋白质的方法，将蛋白质依次进行10 min超声波浴辅助UreaFree还原烷基化反应、90 ℃热变性15 min， 超声波辅助胰蛋白酶酶解15 s。应用此快速酶解方法鉴定3种典型标准蛋白质(牛血清白蛋白、细胞色素C和肌红蛋白)，在25 min内达到与传统整夜酶解方法相同的鉴定结果，并获得更高的序列覆盖率。

【关键词】 超声波辅助; 热变性; 蛋白质; 酶解; 质谱

　　1 引 言

　　目前，用于蛋白质鉴定的方法主要有二维电泳质谱法和多维色谱质谱法[1]。两种方法在酶解后均需要一系列化学处理和提取、纯化步骤以回收酶解碎片，冗长的样品制备过程增加了损耗和污染蛋白质的风险。目前，有关减少蛋白质鉴定前样品预备的时间的方法较多，这些方法主要专注于提高样品处理的通量，基于在酶解步骤中提高温度、使用含有流动胰蛋白酶的柱、加入有机溶剂、用超声波和微波增强胰蛋白酶活性等[2]。Capelo等[3～8]采用高强度聚焦超声波辅助胰蛋白酶快速酶解蛋白质。Park等[9]在蛋白质酶解和质谱分析之前进行蛋白质的热变性，但在热变性过程中蛋白质易聚集，因而未能被广泛采用[10]。本研究综合考察热变性、非尿素试剂变性和超声波辅助等多因素对蛋白质溶液中酶解效率的影响，克服了单因素存在的缺陷;简化了样品预处理步骤，节省了时间，建立了高效率和高通量的蛋白质酶解方法。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　4700 MALDITOFMS (AXIMA QIT，日本岛津公司)， JY92II型超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司); DL180A超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂); UP50H手持式超声波处理器(德国Hielscher公司); GDS8000凝胶成像仪(美国UVP公司); DYA电泳仪(上海西巴斯生物技术开发有限公司)。蛋白质组学常用试剂、标准蛋白质及胰蛋白酶(Proteom icsgrade)购自Sigma公司。SDSPAGE常用试剂(Merck公司)。混合蛋白质标准样品(TaKaRa公司)。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 配制标准蛋白质溶液 用25 mmol/L NH4HCO3溶液分别配制20 mmol/L 二巯基苏糖醇(DTT)溶液和100 mmol/L 碘乙酰胺(IAA)溶液， 并制得浓度为20 g/L各标准蛋白质溶液。

　　2.2.2 蛋白质变性 传统试剂变性过程：在蛋白质样品中加入16 mol/L尿素溶液和20 mmol/L DTT溶液，使尿素和DTT终浓度分别为8 mol/L和10 mmol/L;37 ℃恒温1 h;加入100 mmol/L IAA溶液，使IAA终浓度为DTT终浓度的5倍，于暗处室温反应45 min。热变性过程：蛋白质样品在90 ℃水浴中保温15 min。Ureafree试剂结合热变性过程：在无尿素参与下，蛋白质样品经DTT和IAA还原烷基化反应后，再进行热变性;超声波浴辅助变性过程：使用超声波清洗器(功率180W， 频率40/60 kHz)作为超声波浴，蛋白质样品的各种变性过程在超声波浴中完成。

　　2.2.3 溶液中蛋白质酶解 在100 μL 0.1 g/L变性后的蛋白质样品中加入胰蛋白酶(w(底物)∶w(酶) =40∶1)， 按照下述两种方法进行酶解。(1)传统蛋白质酶解方法：将上述蛋白质样品在37 ℃下酶解12 h。(2)超声波辅助酶解方法：将上述蛋白质样品放置冰浴中，以工作5 s间歇5 s的方式进行超声作用，采用的探头直径为2 mm。煮沸2～3 min，中止酶解反应。

　　2.2.4 SDSPAGE分析 采用5%浓缩胶和14%分离胶分析样品，用凝胶电泳图像分析系统分析数据。酶解效率较高时，酶解后凝胶中样品条带消失或积分光密度(IOD)明显减少。在每张凝胶上都以相同蛋白质浓度的未经过处理的标准蛋白质样品为对照。

　　酶解效率用蛋白质酶解相对百分比(Relative percentage of protein digestion， %)来衡量，计算公式：

　　RPPD=IODoriginal-IODdigestedIODoriginal×100%(1)

　　式中，RPPD表示蛋白质酶解相对百分比，IODoriginal表示未处理标准蛋白质样品的凝胶条带IOD值，IODdigested表示酶解后样品的凝胶条带IOD值。

　　2.2.5 MALDITOFMS分析 酶解后的样品用0.8 μL饱和基质溶液(α氰基4羟基肉桂酸，0.1% TFA，50%乙腈配制)混合，点样后吹干，用4700型MALDITOFMS检测，根据S/N≥20输出质谱数据，利用Mascot的肽指纹谱(Peptide mass fingerprint， PMF)进行检索，允许漏切位点(Missed cleavages)的最大数为1，肽谱中质量偏差±0.1 Da，数据库选择Swiss Prot。 分 析 化 学第38卷第5期李雅萍等：超声波辅助UreaFree试剂结合热变性快速酶解蛋白质

　　3 结果与讨论

　　3.1 超声波参数优化

　　3.1.1 超声功率和超声时间安全区域的建立 PMF鉴定方法的前提是蛋白质被高度专一性酶切。超声波除了具有空穴效应和热效应外，它的机械效应和声流效应都能对蛋白质分子产生撕力，引起分子的随机断裂。这类随机、非专一性断裂必然影响质谱鉴定效率和精确度，如匹配肽段数和氨基酸序列覆盖率下降等。因此，优化超声功率和超声时间是提高超声波辅助蛋白质酶解效率的前提。 图1 超声波功率超声时间安全区域图

　　Fig.1 Safe powertime range for ultrasonication

　　含有9个标准蛋白质的混合蛋白质样品经传统试剂变性后，在没有胰蛋白酶作用的条件下进行不同时间和功率的超声作用。经SDSPAGE分离检测后，蛋白质条带明显消失或蛋白质含量明显下降的超声条件视为非安全区域。建立的超声功率和超声时间的安全区域见图1中斜线部分。在安全区域内，蛋白质分子经超声后基本不发生随机断裂。

　　3.1.2 超声条件的响应面优化 在安全区域内进行两水平的响应面设计以优化超声功率和超声时间。响应面设计见表1(根据超声波仪器功率设置的精度，将各变量的设计值取整后进行实验)。通过式(1)计算酶解效率。表1 响应面设计表

　　Table 1 Scheme of response surface design序号 Run功率 Power (W)时间 Time (s)序号 Run功率 Power (W)时间 Time (s)125.030817.520217.534917.520310.0301017.56428.0201125.01057.0201210.010617.5201317.520717.520 图2 响应面结果的三维(3D)立体图

　　Fig.2 Three dimension plot of response surface design results 响应面3D结果如图2所示。模型的“Prob&>F”值为0.0243，明显小于0.05，说明模型拟合是显著的。求解拟合方程得到各因子的推荐值为：功率22.53 W，超声时间13.03 s，落在因素实验范围内。经实验验证，结果符合最优条件下的预期结果。因此在后续实验中超声时间均采用15 s。

　　3.1.3 超声波辅助酶解与传统方法酶解蛋白质鉴定结果比较 采用超声波辅助酶解方法在15 s内酶解BSA。PMF搜库结果显示能正确鉴定蛋白质。蛋白质序列覆盖率和匹配的肽段数目与传统的12 h酶解方法接近，结果见表2。表2 BSA在传统与超声波辅助酶解方法下序列覆盖率、匹配肽段数目和得分比较

　　3.2 超声波浴辅助UreaFree试剂结合热变性快速变性蛋白质

　　3.2.1 尿素、还原烷基化试剂及热变性对蛋白质酶解效率的影响 虽然尿素是有效的变性剂，但其易分解生成异氰酸盐，在样品制备过程中会导致赖氨酸和半胱氨酸残基上发生人为的氨甲酰化，进而降低氨基酸序列覆盖率和蛋白质鉴定效率[11]。因此， 拟采用热变性取代尿素变性。单纯使用热变性取代全部试剂变性时，部分蛋白质酶解程度不佳，因此在采用Ureafree试剂结合热变性蛋白质之前，应该先考察各因素对酶解效率的影响。细胞色素C在溶液中酶解时对酶解条件非常敏感[9]，采用其作为评估蛋白质。实验结果见表3。4#和5#数据显示，在IAA参与下，不使用尿素同样能够达到100%酶解的效果。2#和6#数据显示，如果IAA不参与反应，无论使用尿素还是DTT，酶解效率仅约为30%。上述两组数据充分说明还原烷基化处理对胰蛋白酶水解蛋白质非常有必要。1#和3#，5#和7#两组数据显示，在IAA参与下，无论使用尿素还是DTT，如果不结合使用热变性，最终酶解效果仅约为20%。上述两组数据充分说明热变性的有效性和必要性。表3 热变性和各试剂对细胞色素C酶解效率的影响

　　protein digestion(%)1#+-+-21.852#++-+33.353#+-++100.004#++++100.005#-+++100.006#-+-+29.787#-++-18.82 +: 参与反应(Participaled); -： 未参与反应(Absent from reaction)。3.2.2 超声波浴辅助UreaFree试剂结合热变性对蛋白质鉴定结果的影响 传统还原烷基化过程耗时较长。为了加速变性过程，使用超声波浴辅助加速Ureafree试剂变性。蛋白质分别经过常规方法(Traditional method: DTT 37 ℃下反应1 h，IAA室温，暗处反应45 min)与超声波浴辅助方法(Ultrasoundbathassisted method:超声波浴辅助下DTT 在37 ℃和IAA在室温暗处各反应5 min)还原烷基化，再全表4 常规和超声波浴辅助方法变性后鉴定蛋白质序列覆盖率、匹配肽段数比较

　　DTT 5 min+IAA 5 min7610部经90 ℃热变性15 min，超声波辅助酶解。SDSPAGE分析结果显示，酶解程度基本相同(酶解效率均接近100%)。

　　表4是质谱鉴定结果。两种方法均能实现正确鉴定，超声波浴辅助方法下的序列覆盖率明显有所提高。说明超声波浴辅助还原和烷基化反应过程能在5 min+5 min内得到与常规1 h+45 min相似的效果。

　　3.3 超声波辅助快速变性、酶解蛋白质方法的验证 肌红蛋白是一种水溶性球蛋白，亲水基团向外，疏水基团向内，易溶于水却不易被酶解，适合用于验证酶解条件。应用超声波辅助Ureafree试剂结合热变性方法快速酶解肌红蛋白，即在无尿素条件下，超声波浴辅助， DTT在37 ℃、IAA在室温暗处各反应5 min;90 ℃热变性15 min;最后进行22 W、15 s超声波辅助酶解。表5 传统与快速酶解方法下肌红蛋白序列覆盖率、匹配肽段数目和得分比较

　　Ultrasoundassisted method54638 质谱鉴定结果如表5和图3所示。肌红蛋白经超声波辅助快速变性、酶解后实现了准确的鉴定，氨基酸序列覆盖率达到63%，略高于传统预处理方法下得到的覆盖率58%。

参考文献

　　1 LUO FuWen(罗福文)， TAO DingYin(陶定银)， ZHAO Peng(赵 鹏)， ZHANG LiHua(张丽华)， JIA YuJie(贾玉杰)， ZHANG YuKui(张玉奎). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2009， 37(10): 1403～1408

　　2 LópezFerrer D， Caas B， Vázquez J， Lodeiro C， RialOtero R， Moura I， Capelo J L. Trends Anal. Chem.， 2006， 25(10): 996～1005

　　3 LópezFerrer D， Capelo J L， Vázquez J. J. Proteome Res.， 2005， 4(5): 1569～1574

　　4 Carreira R J， Cordeiro F M， Moro A J， Rivas M G， RialOtero R， Gaspar， E M， Moura I， Capelo J L. J. Chromatogr. A， 2007， 1153(12): 291～299

　　5 RialOtero R， Carreira R J， Cordeiro F M， Moro A J， Fernandes L， Moura I， Capelo J L. J. Proteome Res.， 2007， 6(2): 909～912

　　6 RialOtero R， Carreira R J， Cordeiro F M， Moro A J， Santos H M， Vale G， Moura I， Capelo J L. J. Chromatogr. A， 2007， 1166(12): 101～107

　　7 Santos H M， Capelo J L. Talanta， 2007， 73(5): 795～802

　　8 Vale G， RialOtero R， Mota A， Fonseca L， Capelo J L. Talanta， 2008， 75(4): 872～884

　　9 Park Z Y， Russell D H. Anal. Chem.， 2000， 72(11): 2667～2670

　　10 Strader M B， Tabb D L， Hervey W J， Pan C， Hurst G B. J. Anal. Chem.， 2006， 78(1): 125～134

　　11 Klammer A A， MacCoss M J. J. Proteome Res.， 2006， 5(3): 695～700