液相色谱质谱联用技术测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖

　　　　作者：王浩 刘艳琴 杨红梅 郭启雷 史海良 阎龙宝

【摘要】 　　建立了无糖食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的高效液相色谱串联四极杆质谱联用测定方法。本方法以水提取样品，以Waters Carbohydrate Analysis柱（300 mm×3.9 mm， 10 μm）分离，流动相为水乙腈（15∶85， V/V），电喷雾负离子MRM模式检测。方法的检出限为0.1 g/kg；线性范围为2.5～125.0 mg/L；加标回收率为86.2％～97.7％；相对标准偏差为3.1%～8.7％。

【关键词】 液质联用仪； 无糖食品; 葡萄糖; 果糖; 蔗糖; 麦芽糖; 乳糖

　　Abstract A LCMSMS method was developed for the determination of glucose， fructose， sucrose， maltose and lactose in sugarfree products. The mass spectrometer was operated in the negative mode using MRM. In this method， samples were extracted with water and chromatographic separation was carried out using a Waters Carbohydrate Analysis column (300 mm× 3.9 mm， 10 μm) with a mobile phase of acetonitrilewater(85∶15， V/V). The limit of detection is 0.1 g/kg and the linear range was obtained from 2.5 to 125.0 mg/L. Overall recoveries were between 86.2% and 97.7%， and RSD value were between 3.1％and 8.7%.

　　Keywords Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Sugarfree products; Glucose; Fructose; Sucrose; Lactose

　　1 引 言

　　20世纪70年代，无糖食品问世。最初的无糖食品只是除去食品中的蔗糖或是添加盐分，随着新型甜味剂的不断出现，无糖食品得到迅速发展，品种由最初的十几种发展到上万种。我国强制性标准GB 134322004《预包装特殊膳食用食品标签通则》中规定：只有符合糖(指所有的单糖和双糖)在固体或液体食品中的总含量低于0.5 g/100 g(100 mL)，才可以在产品标签上标注“无糖”；低糖食品的标准为糖(指所有的单糖和双糖)在固体或液体食品中的总含量低于5 g/100 g(100 mL)。
　　
　　目前，检测食品单糖和双糖的方法有化学法［１］、高效液相色谱法等[２～８]和质谱法［9］。液相色谱法与现在使用的测定糖含量的菲林滴定法相比具有灵敏度好、检测速度快、适用范围广的特点，但是也存在方法检出限低，排除干扰能力差等缺点。目前，我国检测食品单糖和双糖的最新标准检测方法GB/T2222.12008《食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定 高效液相色谱法》中规定：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的检出限均为0.4%，而且，不能消除无糖食品中广泛添加的糖醇等甜味剂对单糖和双糖测定时产生干扰。因此，寻求简便、快速、准确、敏感性高、选择性好的无糖食品中单糖和双糖的检测方法，才能为我国无糖食品中单糖、双糖的日常监管工作提供技术支持，从而保障无糖食品的食用安全。本方法采用高效液相色谱串联质谱技术同时测定和确证无糖食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、测定周期短等优点。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　6410 型串联三重四极杆质谱（美国Agilent公司）， 配Agilent 1200型液相色谱仪； GL88b型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）； KQ5200型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）； TGL16M型高速台式冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。 MilliQ去离子水发生器（美国MilliQ公司)。

　　乙腈（色谱纯）；葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度98%～99%。

　　2.2 分析条件

　　2.2.1 色谱条件

　　Waters Carbohydrate Analysis色谱柱（300 mm×3.9 mm i.d.， 10 μm；预柱： 12.5 mm×4.6 mm i.d.， 10μm）； 流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相：水乙腈（15∶85， V/V）。

　　2.2.2 质谱条件

　　离子源：大气压化学电离离子源(APCI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N2 ；雾化气压力：344.8 kPa；干燥气温度：325 ℃；干燥气流速：9 L/min；汽化温度：350 ℃。各种单糖、双糖的质谱分析条件参数见表1。 表1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质谱参数（略）

　　2.3 样品处理

　　2.3.1饮料等液态食品

　　准确吸取样品溶液2.5 mL至50 mL容量瓶中，用水定容，涡旋混匀。准确吸取此溶液5.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，涡旋混匀。用快速定性滤纸自然过滤（不易过滤的浑浊溶液转移至离心管中，以5000 r/min离心10 min，吸取上清液以0.20 μm滤膜过滤）。滤液过0.20 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪分析。

　　2.3.2 糕点等固态食品

　　称取2.5 g样品(精确至0.01 g)，置于50 mL容量瓶中，用水定容，涡旋混匀，超声提取30 min。准确移取提取溶液5.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，涡旋混匀后用快速定性滤纸自然过滤。滤液过0.20 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪分析。

　　3 结果与讨论

　　3.1 样品前处理方法的优化

　　Nh3色谱柱是以正相模式分离糖类物质的色谱柱，是将氨丙基单体键合到高比表面积的球形硅胶载体上而制得。在正相操作条件下，水比乙腈的极性更强。因此，只有当测定溶液中乙腈含量≥50%时，才能保证色谱峰的峰形尖锐，否则色谱峰会展宽；其次，样品提取液与乙腈1∶1(V/V)混合，可以有效去除提取液的蛋白质。综合以上考虑，实验采用２．３节的样品处理方法，既能减小样品基质对测定结果的干扰，又能保证测定溶液中单糖和双糖色谱峰的完好，同时除去样品提取液中蛋白质。实验结果表明，本处理方法使样品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖有较高的稳定性，并可获得满意的提取效率。

　　3.2 质谱条件的优化

　　采用直接进样方式分别将每种1 g/L的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准溶液分别注入离子源中，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的分子离子分别为m/z 179， 179， 341.1， 341.1和341.1。以每种糖的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息， 然后再对得到每种糖的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使每种糖的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，从而得到每种糖的最佳质谱参数(如表1所示)。

　　3.3 色谱条件的优化

　　3.3.１ 色谱分离条件选择

　　实验选择Nh3色谱柱以正相模式分离糖类物质，选用水和乙腈的混合液为流动相。适当增加流动相中乙腈含量有助于果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的分离。实验发现，采用水乙腈（15∶85， V/V）时，可以较好地分离样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖(如图1所示)。

　　3.3.２ 流速及进样量的选择

　　本实验在0.2～2.0 mL/min范围内考察了流动相流速的影响， 发现流速为1.0 mL/min时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖出峰时间合适， 且峰形较好。
　　
　　大进样量可提高测定的灵敏度，但是容易污染色谱柱。实验发现，当进样量达到10 μL时， 灵敏度能达到要求，且对色谱柱影响不大。

　　3.4 线性范围与检出限

　　用50%(V/V)乙腈水溶液逐级稀释的标准工作液（2.5， 5.0， 25， 50.0和2.0 mg/L）分别进样10 μL，以样品的峰面积(y，Counts)对浓度（x， mg/L）进行线性回归（表2），线性范围为2.5～125.0 mg/L。用空白样品提取液进行加标实验，在信噪比均大于3的条件下能检出，将此添加量定为检出限。按照2.3节的步骤操作，进样量为10.0 μL时，样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的方法检出限均为0.1 g/kg。表2 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的工作曲线回归方程和线性相关系数、检出限（略）

　　3.5 方法的回收率和精密度

　　每组准确称取无糖糕点样品6份，，每份2.5 g， 共3组，分别定量加入果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准样品，添加水平分别为0.2， 1.0和5.0 g/kg，按供试品溶液制备方法制备后进行测定， 结果见表3。从表3可见，平均加标回收率为86.2%～105.5%，平均相对标准偏差为2.37%～8.72%（n=6）。表3 无糖糕点样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖加标回收率（略）

　　3.6 实际样品检测

　　利用本方法对国内市场销售的55种无糖或低糖食品（包括：饮料、糕点、饼干、燕麦片、核桃粉、黑芝麻糊、口香糖等）进行检测。5种糖的含量分别为; 果糖0～9.06 g/kg；葡萄糖0～51.05 g/kg；蔗糖0～111.36 g/kg；麦芽糖0～230.74 g/kg；乳糖0～45.73 g/kg。55种无糖或低糖食品中，有30种食品的总糖含量(包括果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等) 小于5 g/kg，占总数的54.5%。实验表明，本法样品操作简单， 灵敏度高， 明显提高了检测效率，适用于快速测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。

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