高通量悬浮芯片技术检测多农兽药残留

　　　　作者：刘楠 苏璞 朱茂祥 杨陟华 潘秀颉 王红勇 晁福寰 高志贤

【摘要】 建立了一种同时可检测多农兽药残留的高通量悬浮芯片技术。以常用的7种农兽药为待测靶标物，通过优化条件，使抗原抗体基本完全反应，操作简便快捷，最多可同时检出7种农兽药残留靶标物;实验结果表明，高通量悬浮芯片检测标准回归曲线方程和相应的决定系数R2表现良好;在对含有多种农兽药残留的不同盲样的检测中，检测浓度值与实际浓度的相对偏差较小。高通量悬浮芯片技术为多农兽药残留的快速检测提供了新方法，此系统可用于多农兽药残留实际样品的初步检测，整个检测过程仅耗时1～2 h，基本上满足了多农兽药残留检测的灵敏、特异、快速和高效的需求，具有广阔的应用和发展前景。

【关键词】 悬浮芯片; 高通量; 微球; 残留; 中位荧光强度值

　1 引 言

　　食品安全已成为社会共同关注的公共卫生问题[1]。其中，环境和食品中农兽药残留已引起广泛关注，农兽药残留量已成为重要的检测指标。因此，研究食品中微痕量农兽药残留的快速分析及残留监控的方法具有重要意义。阿特拉津(Atrazine， Ar)、克伦特罗(Clenbuterol， CL)和氯霉素(Chloramphenicol， CAP)等农兽药残留多采用色谱法[2，3]、色谱质谱联用法[4，5]和酶联免疫吸附法(ELISA) [6，7]测定。色谱质谱联用法和色谱法虽然灵敏度高，但实验室条件要求高，检测方法复杂，费时费力，成本高;ELISA法每次只能检测一种靶标物，不能满足对多农兽药残留的高通量多元分析要求。因此，建立一种灵敏、快速、高通量的检测技术势在必行。悬浮芯片技术是美国Luminex公司开发的一种多功能的液相芯片分析平台，具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点;与固相芯片相比，液相芯片具有灵活性更好，可以根据需要调节每次检测所需要的微球的数量和调整检测体系的设计[8]。目前，对该技术的研究集中于检测大分子蛋白质和核酸 [9，10]，本研究组曾采用悬浮芯片结合酶免疫法检测了3种兽药残留[11]。本研究以常用的4种兽药(氯霉素、克伦特罗、雌二醇和泰乐菌素)和3种农药(阿特拉津、吡虫啉和甲萘威)共为靶标物，基于间接竞争法的免疫学检测原理，改进了常规悬浮芯片技术在微球上固定抗体的方法，根据待测靶标物灵活自由组合，可同时检出7种农兽药残留靶标物;本方法简便、快捷，降低了实验成本，结果稳定可靠，具有一定的实际应用价值。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　BioPlexTM悬浮系统 (美国BioRad公司); 6930型冷冻离心机 (日本KUBOTA公司); MS3Digital型旋涡混匀器 (德国IKA公司); Costar96孔酶标板 (美国Corning公司)。

　　实验室偶联有7种农兽药蛋白结合物的不同编码的羧基荧光检测微球[11];蛋白氨基偶联试剂盒(美国BioRad公司)，内含激活缓冲液(Activation Buffer);Ar、CAP、CL、吡虫啉(Imidacloprid， Im)、甲萘威(Carbaryl， Cbl)、雌二醇(17βestradiol， E2)和泰乐菌素(Tylosin， Tyl) 均购于美国Sigma公司;链霉亲和素藻红蛋白(Strepavidinphycoerythrin， SAPE，美国Invitrogen公司);牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin， BSA， 德国Roche公司);CAP单抗(CAPmAb)和E2单抗(E2mAb)购自美国Biodesign公司;CL单抗(CLmAb，英国Abcam公司);Ar单抗(ArmAb)和Im单抗(ImmAb)购自北京万华普曼生物工程有限公司;Tyl单抗(北京望尔生物工程有限公司);Cbl多隆抗体(CblpAb， 中国农业大学许艇惠赠)。其它试剂均为国产分析纯。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 悬浮芯片反应抗体加入量的优化和筛选 7种抗体各分别分为5个梯度加入，分别取出7种偶联过兽药结合物的微球2000个，每个梯度做3个平行样，根据检测所获得的中位荧光强度值 (Median fluorescent intensity， MFI)来确定最佳抗体加入量。以进入平台期拐点的抗体加入量为最适特异性生物素化抗体加入量。

　　2.2.2 农兽药残留多元分析的悬浮芯片标准曲线绘制 在96孔酶标反应板的各孔中分别加入优化后的7种农兽药靶标物对应的生物素化单抗，分别将这7种农兽药标准品梯度稀释加入。将微球等比例混合，每孔加入14000个(2000/种beads，共7种)，每孔用PBS缓冲液补足至50 μL，同时准备一个不加任何标准品的阳性对照孔。37 ℃中速漩涡振荡1 h，使微球上的靶标农兽药蛋白结合物与溶液中相应的标准品共同竞争生物素化单抗，然后每孔加适量SAPE，37 ℃中速振荡30 min。悬浮芯片系统进行检测，获得MFI。以各种靶标标准品的浓度为横坐标，以检测得到的MFI为纵坐标，得7种农兽药的悬浮芯片高通量检测标准曲线。

　　3 结果与讨论

　　3.1 农兽药最适生物素化抗体加入量的优化 图1 7种生物素化农兽药抗体加入量和MFI的关系

　　Fig.1 Relationship between volumes of the seven biotinylated antibodies and median fluorescence intensity(MFI)

　　7种农兽药生物素化抗体在不同加入量时所获得的MFI如图1所示。实验表明，MFI值起初随抗体加入量增加而增大，到某一个拐点处进入缓慢增大或平台期; 继续增大抗体加入量并未明显地使MFI增大。该7个拐点的抗体加入量可被认为是最适加入量(每2000个反应微球)。曲线到拐点处变化趋缓，这是由于微球上的抗原逐渐与溶液中的特异性抗体反应直至达到饱和。

　　由于Cbl所用的抗体为多克隆抗体，抗体加入量较多，直到加入200 ng才达到较为理想的结果。为节省抗体，本实验抗体加入量选定为200 ng。表1 各种农兽药分析物优化后的悬浮芯片反应条件

　　1 h for AgAb reaction and 0.5 h for SAPE reaction * SAPE稀释度(Dilution ratio): 1∶100; 激活缓冲液(Activation buffer): 0.1 mol/L PBS， pH 7.4。 抗体最适加入量和其它反应条件(SAPE稀释度、激活缓冲液、温度和悬浮芯片抗原抗体反应时间)如表1所示。通过优化实验条件，克服了常规悬浮芯片技术步骤繁琐、实验耗时长的不足，基本达到抗原抗体的完全反应。操作简便快捷，无需常规Luminex实验所必需的昂贵的滤膜板和抽滤泵，采用普通96孔细胞培养板或酶标板即可，也无需进行反复多次的抽滤步骤[13，14]。

　　3.2 悬浮芯片法同时检测7种农兽药残留标准曲线的测定

　　7种农兽药标准品依优化好的浓度梯度，按实验步骤进行标准曲线的绘制。由图2可见，7种农兽药的微球探针都可被悬浮芯片仪准确识别。

　　图2 7种农兽药的悬浮芯片检测的微球分布图

　　Fig.2 Beads map of suspension array detection for seven pesticides and veterinary drugs通过间接竞争法，获得多元分析的标准曲线方程(图3)和检测区间如表2所示。在检测范围内，标准曲线方程得到良好的响应， R2&>0.99。 图3 悬浮芯片系统检测7种农兽药的标准回归曲线

　　Fig.3 Standard regression equations for the detection of seven pesticides and veterinary drugs目前无检测E2的国标，但在实际应用中该检测范围和检出限可满足日常农兽药残留检测需要，亦可用于对E2的临床检测，但需对血清进行必要的前处理[15]。文献[11，15]已证实，悬浮芯片对多农兽药残留检测的特异度良好。

　　3.3 实际样品的检测

　　在2～3种兽药盲样检测的基础上[11，15～17]，进行了6种农兽药盲样的检测实验(表3)。实现了6种农兽药的悬浮芯片高通量多元分析，整个检测过程仅需1～2 h，在多种农兽药残留的混合检测中，获得了有效的MFI，除了Cbl的检测结果与实际浓度偏差较大(25.12%)外，其它各种农兽药检测的偏差在0.75%～17.38%之间，与3种兽药盲样的高通量悬浮芯片检测的相对误差相当[17]。由于Cbl使用的表2 7种农兽药高通量悬浮芯片检测标准回归曲线方程

　　R2=0.99202.0～400是多抗，虽然纯化过，但抗体的非特异性吸附和微球间交联较其他农兽药单抗严重，使得检测所得结果较其他各种靶标物偏差较大，如果用Cbl的单克隆抗体可有效解决此问题。表3 混合盲样中6种农兽药残留的检测结果表4 7种农兽药低残留混合盲样的检测结果 农兽药多残留7通道的盲样检测结果见表4。检出浓度与实际浓度的偏差在2.3%～27.8%之间，只有Cbl和Tyl的略大。总体而言，7通道悬浮芯片法检测的准确性和对不同浓度小分子物质的抗干扰能力较强，偏差相对较小。目前，7通道农兽药残留的检测已是现有技术的极限，可初步证明该技术可应用于实际样品检测。可见，悬浮芯片法在对多种农兽药残留的高通量检测分析中有明显优势，检测仅需1～2 h。

　　对多种农兽药同时检测的高通量悬浮芯片实验证实了根据检测靶标物自由搭配、灵活多变的组合方式的可行性。在这7种靶标物的检测范围内，根据所要检或可疑的多种待测物，任意组合和搭配，形成不同的检测试剂盒。这种优势也为今后检测试剂盒的产业化和商品化提供了可能。

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