反相色谱条件下三唑类手性农药对映异构体的拆分

　　　　 作者：田芹 任丽萍 吕春光 周志强

【摘要】 采用自制的纤维素三(3，5二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相(CDMPCCSP)和直链淀粉三(3，5二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相(ADMPCCSP)，在反相色谱条件下成功地拆分了己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇对映异构体。考察了固定相类型、不同比例的甲醇/水或乙腈/水做流动相、柱温等因素对三唑类手性农药拆分的影响，优化了色谱分离的条件。结果表明：两种固定相都有很强的拆分能力。在优化的色谱条件下，己唑醇和烯唑醇在这两种固定相上都能被分离; 三唑酮只能在CDMPC CSP上分离;粉唑醇、戊唑醇、烯效唑只能在ADMPCCSP上分离。流动相中水的含量增加会使对映体的保留增强，分离的可能性增大。在0～40 ℃研究温度范围内，容量因子k随温度的升高而减少，除烯效唑与戊唑醇外，其它手性农药的选择因子α也随温度的升高而减少，而分离度Rs随温度变化没有明显的规律，最好的分离度不都出现在低温。对映体流出顺序用圆二色检测器测定。

【关键词】 三唑类手性农药; 手性拆分; 反相色谱; 手性固定相

　　1 引 言

　　近年来，随着手性技术的发展，有关光学活性农药的研究已成为农药化学领域的热门课题。在已商品化的农药中，约有26%的农药具有手性中心，其中大部分都是以外消旋体的形式出售和使用[1]。将外消旋的手性农药施加于生物体时，对映体之间的差异不仅表现在生物活性上，还表现在对生物体的毒性、体内的吸收、转移、代谢以及消除等方面。因此建立高分离度、高灵敏度的手性农药拆分和测定方法具有重要的意义。常用的手性分离方法有高效液相色谱法、气相色谱法、分子烙印和毛细管电泳法等[2]，其中高效液相色谱手性固定相法是重要的一种。在众多的手性固定相中，多糖(常用纤维素和淀粉)衍生物CSPs显示出拆分能力强、适用范围广等优点[3]。己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇等均属于三唑类农药，是一类重要的广谱杀菌剂，化学结构式见图1。有关其对映体的拆分方法主要有气相色谱法[4]、毛细管电泳法[5]、手性流动相添加剂法[6]、手性固定相法[7，8]和多糖类手性固定相法[9，10]等。而多糖类手性固定相高效液相色谱法主要在正相条件下对三唑类农药进行拆分。本研究利用自制的纤维素三(3，5二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相(CDMPCCSP)和直链淀粉三(3，5二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相(ADMPCCSP)，在反相色谱条件下，以甲醇/水或乙腈/水为流动相，在高效液相色谱仪上实现了己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇对映体的拆分。比较了固定相、流动相、温度对手性拆分的影响，同时利用圆二色检测器测定了对映体的流出顺序。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1100型高效液相色谱仪(Agilent公司)，配二极管阵列检测器;JASCO 2000高效液相色谱仪(日本JASCO公司)，配圆二色检测器;液相色谱装柱机(北京福思源机械加工部);AT930制冷、加热两用色谱柱温箱(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。3，5二甲基苯基异氰酸酯(Merck公司);直链淀粉球(Sigma公司);微粒硅胶(中国科学院兰州化物所)：球形，粒度5～7 μm，比表面积110 m2/g，平均孔径6.7 nm;微晶纤维素(上海试剂四厂);3氨基丙基三乙氧基硅烷(KH550，辽宁盖县化工厂)。所用试剂均为分析纯，流动相重蒸后使用。6种三唑类手性农药由中国农业大学农药残留分析组提供。

　　2.2 手性固定相的合成

　　参照文献[11，12]的方法合成手性固定相CDMPC和ADMPC，于37 MPa压力下装入不锈钢柱。

　　2.3 色谱条件

　　色谱柱：CDMPCCSP (250 mm×4.6 mm)，ADMPCCSP(150 mm×4.6 mm);流动相为甲醇水或乙腈水;流速为0.8 mL/min(CDMPC)和0.5 mL/min(ADMPC);进样量10 μL，检测波长230 nm。容量因子(k)、选择因子(α)和分离度(Rs)分别按公式k=(t-t0)/t0，α=k2/k1，Rs=2(t2-t1)/(w1+w2)计算。

　　3 结果与讨论

　　3.1 不同固定相及流动相组成对对映体拆分的影响

　　在CDMPCCSP和ADMPCCSP上以甲醇水或乙腈水为流动相对三唑类农药己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、戊唑醇和三唑酮对映异构体进行了直接的手性拆分。在优化的色谱条件下，己唑醇、烯唑醇和三唑酮在CDMPC上分离度分别达1.72， 1.31和1.55;己唑醇、烯唑醇、粉唑醇、烯效唑和戊唑醇在ADMPC上分离度分别达到1.28， 2.75， 1.05， 2.41和1.30，典型色谱图见图2。在同一种固定相、不同的流动相对样品的保留、立体选择性也不同。如在ADMPCCSP上，烯唑醇和粉唑醇只能在甲醇水作流动相下拆开，已唑醇则只能在乙腈水作流动相下拆开。甲醇既是质子的受体也是供体;乙腈只是质子的受体。这说明氢键不一定是反相条件下拆分的主要作用力。随着流动相中水含量的增加，分离的可能性增大，但考虑到柱子的寿命和柱效，本实验中水分含量对于甲醇和乙腈分别达40%和60%。本研究组曾报道在正相色谱条件下，戊唑醇和三唑酮可以在CDMPC上拆分[9]。氢键、ππ、偶极偶极作用通常被认为是多糖类固定相在图2 三唑类手性农药在ADMPCCSP上反相条件下的拆分色谱图

　　Fig.2 Chromatograms showing the enantiomeric separation of triazole chiral pesticides

　　a. 己唑醇(Hexaconazole)， 乙腈/水(ACN/water) 45∶55， V/V; b. 烯唑醇(Diniconazole)， 甲醇/水(Methanol/water)， 80∶20， V/V; c. 粉唑醇(Flutriafol)， 甲醇/水(Methanol/water) 70∶30，V/V; d. 烯效唑(Uniconazole)， 乙腈/水(ACN/water) 60∶40， V/V; e. 戊唑醇(Tebuconazole)， 乙腈/水(ACN/water)， 50∶50， V/V; 室温(Room temperature); 流速(Flow rate) 0.5 mL/min。正相色谱条件下拆分的有效作用力[13];而在反相条件下，强极性流动相更容易与CSP形成强的氢键作用，从而减弱了溶质分子与CSP的氢键作用，这将可能使分析物在固定相的螺旋型手性空穴中的包容作用和“立体适应性”(Steric fit)、疏水作用、ππ、偶极偶极相互作用成为手性识别的关键因素。

　　3.2 温度对对映体拆分的影响

　　在0～40 ℃范围内，考察了温度对三唑类手性农药对映体拆分的影响。结果表明，所研究的手性农药对映体的容量因子k随着温度的升高而减小;选择因子α没有一致的规律;不同农药的最佳分离度出现在不同的温度，而不是都出现在低温。温度对手性对映体容量因子k、 图3 烯效唑在ADMPCCSP上甲醇水(80∶20， V/V)作流动相下lnα与1/T的关系图

　　Fig.3 Plot of lnα vs 1/T of uniconazole in methanol/water (80∶20， V/V) on amylose(tris3，5 dimethylphenylcarbamate)(ADMPCCSP)选择因子α的影响可以用下式表示[14，15]：

　　lnk=-ΔH°RT+ΔS°R+ln和lnα=-ΔΔH°RT+ΔΔS°R

　　通过测定不同温度下的容量因子k和手性选择因子α，以lnk和lnα分别对1/T作图，各自可以得到一条直线。通过考察温度对手性分离的影响，可以计算出手性分离过程中的热力学参数，从而对手性分离过程有更加深入的了解。除了烯效唑的选择因子的自然对数与绝对温度的倒数在甲醇作改性剂时在ADMPC上不呈线性关系(图3)，其它手性农药的van′t Hoff曲线都具有线性，计算得到的热力学参数见表1。戊唑醇在甲醇作改性剂时，在ADMPC上的手性拆分主要受熵控制，而在乙腈作改性剂时主要受焓控制;其它农药(除烯效唑)手性拆分主要受焓控制。表1 0～40 ℃范围内，手性农药对映体的Van′t Hoff方程和ΔΔH°、ΔΔS°

　　3.3 对映体的流出顺序

　　近年来，高效液相色谱圆二色检测器已成为手性化合物分析的有力工具[16，17]。本研究利用高效液相色谱圆二色检测器测定了对映体流出顺序(见表2)，3种三唑类手性农药在CDMPCCSP上，2种流动相条件下，同一波长下的流出顺序一致;而在ADMPCCSP上，烯效唑与烯唑醇的出峰顺序相反，其它手性农药出峰顺序一致。产生这种现象的原因尚不清楚，一般认为是流动相成分的改变导致了手性空腔的立体环境发生变化所致[18，19]。表2 三唑类手性农药在CDMPCCSP和ADMPCCSP上反相条件下对映体流出顺序

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