新型聚合物单分散温敏色谱固定相的制备及其在生物大分子分离中的应用

　　　　 作者：欧阳康龙 孙彦璞 龚波林

【摘要】 　　以2.5 μm的单分散聚苯乙烯为种子，乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)为交联剂，甲苯和环己醇为致孔剂，采用“一步种子溶胀聚合法”制备了单分散微球; 再以过硫酸钾为引发剂将水溶性温敏单体N异丙基丙烯酰胺(NIPAM)分子引发聚合到微球表面，制备了粒径为7.0 μm、分散系数为0.02的单分散交联温敏色谱填料，温敏单体NIPAM的接枝率为5.2%。考察了该填料对标准蛋白质的分离性能、温敏性能、稳定性和重现性以及动态吸附容量对蛋白保留的影响。实验结果表明，该色谱填料对蛋白的分离性能、温敏性能、稳定性及重现性良好，且对溶菌酶的动态吸附容量为32.3 mg/g。在疏水模式下，该填料不但可以同时基线分离5种标准蛋白，而且通过改变温度可以有效地将3种在低温下保留时间重叠的蛋白(细胞色素C、β乳球蛋白和核糖核酸酶)完全分离。

【关键词】 N异丙基丙烯酰胺; 单分散温敏色谱固定相; 蛋白质分离

　　Abstract By using 2.5 μm monodisperse polystyrene as seeds， ethylene glycol dimethyl acrylate(EDMA) as crosslinking agent， toluene and cyclohexanol as porogen， onestep of seed swelling polymerization method was applied for the preparation of monodisperse beads. Then the monomer of Nisopropylacrylamide(NTPAM) was polymerized on the surface of monodisperse beads by watersoluble initiator(potassium persulfate) to prepare a 7.0μm monodisperse thermosensitive chromatographic stationary phase. Its dispersion coefficient is 0.02 and the grafting yield of NIPAM is 5.2%. The stationary phase was evaluated in detail to by determining its separability， thermosensitivity， stability， reproducibility and the effect of the dynamic protein loading capacity on the retention of proteins. The results show that the packing has good separability， thermosensitivity， stability， reproducibility and the dynamic protein loading capacity for lysyme is 32.3mg/g. In the hydrophobic interaction chromatographic model， five standard proteins can be separated by the stationary phase， and cytochome C， βlactoglobulin， ribonmclease A can be effectively separated by changing the temperature.

　　Keywords NIsopropylacrylamide; Monodisperse thermosensitive chromatographic stationary phase; Separation of proteins

　　1 引 言

　　N异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，由于其大分子链上同时具有亲水性的酰氨基和疏水性的异丙基，使得聚NIPAM的水溶液在32 ℃附近具有最低临界溶液温度(LCST)[1] 。 当温度低于LCST时，表现为以酰胺基为主的亲水模式;当温度高于LCST时，表现为以异丙基为主的疏水模式。通过调节温度可以实现对目标物有效分离和提纯的目的。

　　NIPAM及其共聚物表现出相转变，产生热敏性质。利用其热敏性质，可以制备多种智能高分子材料。这些高分子材料在生物医学[2]、免疫分析[3]、催化[4]及分离提纯[5]等领域都有广泛的应用。近年来，温敏材料在色谱研究中的应用日趋广泛。

　　为了研究和应用NIPAM的温敏性质，文献[6]合成了纳米SiO2/PNIPAM水凝胶;文献[7]制备了温敏性互穿网络(Interpenetrating polymer networks，IPN)的PNIPAAm凝胶;文献[8]采用聚甲基丙烯酸2羟乙基酯(PHEMA)接枝改性PNIPAAm，提高了PNIPAAm网状结构的亲水性，增强了其柔韧性和生物相容性。目前， 温敏性高聚物在超细硅胶表面接枝的方法有共聚法[9]、偶联法[10]和传统自由基引发法[11]。原子转移自由基聚合(ATRP)技术自问世以来，用于无机材料表面的热敏性聚合物的接枝改性已有报道[12，13]。

　　本研究以2.5 μm的单分散聚苯乙烯为种子，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，甲苯和环己醇为致孔剂，采用“一步种子溶胀聚合法”制备单分散微球，再以过硫酸钾为引发剂将水溶性单体NIPAM分子引发聚合到微球表面，制备了粒径为7.0 μm的单分散交联聚合物温敏色谱固定相。考察了该填料对标准蛋白的分离性能、温敏性能和动态吸附容量等性能。结果表明，该填料合成方法简单，具有分离性能、温敏性能良好和吸附容量大等优点。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　LC20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司); CGY100型高压气动泵(北京福思源机械加工部); 2003型电动搅拌器; JY92超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司); KQ250B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司); N异丙基丙烯酰胺(NIPAM，上海物竞化工科技有限公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，美国Aldrich公司);苯乙烯(St，化学纯，上海试剂一厂);过氧化苯甲酰(BPO，化学纯，上海润捷化学试剂有限公司);十二烷基磺酸钠(SDS，化学纯，汕头光华化工厂);聚乙烯醇(PVA，化学纯，醇解度为88%，天津大学化工实验厂);肌红蛋白(Myo，马心)、核糖核酸酶原(RNaseA，牛红细胞)、α糜蛋白酶原A(αChyA，牛胰脏)、细胞色素C(CytC，马心)、溶菌酶(Lys)、β乳球蛋白(βLact，牛奶)均购自美国Sigma公司，其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

　　2.2 固定相的合成与表征

　　将适量粒径为2.5 μm的聚苯乙烯种子置于三颈瓶中，加入适量0.2% SDS溶液，在室温下搅拌。将适量的BPO和EDMA置于干燥的烧杯中，超声使BPO完全溶解，然后加入适量的甲苯、环己醇、PVA和SDS溶液，超声乳化至无油滴后，迅速加入到聚苯乙烯种子溶液中，室温下搅拌溶胀24 h。通氮气30 min，升温至70 ℃，聚合一定时间后，在氮气保护下迅速加入适量的过硫酸钾和NIPAM，继续反应20 h。反应结束后，离心、洗涤、索氏提取器抽提48 h， 50 ℃真空干燥3 h，即可获得单分散聚合物温敏色谱固定相[14，15]。

　　合成的温敏固定相颗粒大小与表观形态用扫描电子显微镜观测;由元素分析得出单体的接枝率。

　　2.3 固定相动态吸附容量的前沿色谱法测定

　　使用5 cm×0.46 cm 温敏柱，在流动相为50 mmol/L PBS+1.5 mol/L(NH4)2SO4+1.0 mg/mL Lys，流速为1.0 mL/min的条件下，采用前沿突破曲线法测定该固定相的动态吸附容量。

　　2.4 色谱柱的装填及色谱条件

　　以蒸馏水为匀浆液和顶替液，在30 MPa压力下以匀浆法将自制的单分散聚合物温敏填料装入不锈钢柱管(5 cm×0.46 cm I.D.)中。流动相: A液(洗脱液)为50 mmol/L Nah3PO4+1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0)，B液(平衡液)为50 mmol/L Nah3PO4(pH 7.0)，所有流动相在使用前均经0.45 μm滤膜过滤。检测波长为280 nm。

　　3 结果与讨论

　　3.1 固定相粒度的控制及表征

　　采用分散聚合和溶胀聚合相结合的方法制备单分散交联树脂，欲合成的单分散树脂粒径的大小取决于所用种子的粒径以及种子被有机相EDMA所溶胀的倍数[16]。本实验选用的种子粒径为2.5 μm，溶胀倍数为40倍。图1为所制备的温敏固定相的电镜照片。

　　由图1可以看出，该填料具有单分散性，分散系数为0.02，粒径为7.0 μm。

　　在制备单分散大孔微球时，选用甲苯和环己醇作为混合致孔剂。在该溶胀聚合反应中，甲苯是热力学不良溶剂，可以产生大孔，而环己醇是热力学良溶剂，可以产生小孔和微孔。以这两种混合溶剂作为混合致孔剂可以制备表面光滑的微球，避免了所制备的微球表面有凹孔的缺陷，而且接枝上的单体NIPAM对微球的孔不会产生影响。

　　在聚合过程中，由于同时使用甲苯和环己醇作致孔剂不但可以使单体接枝到颗粒的外表面，而且可以接枝到颗粒的内表面，从而提高了单体的接枝率。由元素分析数据(N: 0.647;C: 57.59;H: 7.486)得5.2%单体被接枝到微球上。

　　3.2 温敏色谱固定相的动态吸附容量

　　在色谱中，柱容量的大小与固定相基质的结构和比表面积的大小、配基的结构及作用基团的密度、色谱条件、分离对象等因素有关。若单位体积的填料中作用基团多，则对蛋白质的吸附点多，柱容量大。本实验以Lys为溶质测定所合成的温敏固定相的动态吸附容量为32.3 mg/g。

　　3.3 温敏柱性能的考察

　　以NIPAM为单体的固定相，当温度低于LCST时，主要表现为酰胺基的亲水模式，与蛋白的相互作用力较弱，导致蛋白的保留时间较短，从而使蛋白很快洗脱下来;随着温度的升高，固定相表面的温敏单体分子链逐渐收缩，当温度高于LCST时，则主要表现为链端异丙基的疏水模式，使蛋白与固定相之间的作用力增强，因此增加了对蛋白的保留时间。为了考察该温敏固定相的分离性能，本实验对CytC， βLact，Myo，Lys，αchy A进行了分离，如图2所示。由图2可见，该固定相具有良好的分离性能。

　　为了进一步考察该固定相的温敏性能，在低温和高温下对CytC，βLact和RnaseA进行了分离(见图3)。低温时，3种蛋白的保留时间基本一样，很难分离;当升高温度时，由于固定相表面极性的改变导致对各蛋白的作用力大小不同，使蛋白的保留时间发生不同程度的变化，从而能够很好地分离。这主要是由于温敏单体分子中两种极性不同的官能团在不同温度下的作用不同而引起的。

　　3.4 单分散温敏色谱柱稳定性

　　色谱柱的稳定性和使用寿命是考察柱性能好坏的重要指标之一。该温敏色谱固定相的稳定性是在极端的pH值条件下测试的。温敏柱用0.5 mol/L的h3SO4和NaOH洗涤，再用于分离蛋白， 其分离性能不变，说明该柱有较好的稳定性，可以在pH 1～12范围内使用。该温敏柱连续进样40次， 柱子的分离度没有明显降低，说明该柱有良好的重现性。

　　实验结果表明，该单分散温敏柱具有柱压低、机械强度高、动态吸附容量高、温敏性能好的优点。该固定相在生物大分子的分离和纯化方面会有很好的应用前景。

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