作者：黄清春，储永良，接力刚，沈鹰，陈纪藩，陈光星，王捷
【摘要】 目的 观察通痹灵对体外培养的类风湿关节炎(RA)滑膜细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法 行关节腔镜手术取RA患者膝关节滑膜组织消化分离滑膜细胞进行分组培养。空白对照组：含生理盐水＋10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵低剂量组：50 mg/L通痹灵＋10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵高剂量组：200 mg/L通痹灵＋10%胎牛血清的DMEM培养。提取总RNA，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组VEGF mRNA的表达。结果 通痹灵高、低剂量组VEGF mRNA表达较对照组明显降低(P＜0.05)。结论 通痹灵可以下调RA患者滑膜细胞VEGF mRNA表达水平，从而可以通过抑制VEGF表达减轻滑膜血管翳增殖。
【关键词】 通痹灵；类风湿关节炎；滑膜细胞；血管内皮生长因子
Abstract：Objective To study effect of Tongbiling (TBL) on VEGF mRNA expression in RA synovlcytes cultured in vitro and explore its mechanism. Method Synovial cells from the knee joint in patient with RA were digested， pided and separately cultured after arthroscopy. Blank controls：DMEM culture containing 10% FBS in saline；Low-dose admission group of TBL：DMEM culture containing 10% FBS in 50 mg/L TBL；High-dose admission of TBL：DMEM culture containing 10% FBS in 200 mg/L TBL. RNA were distilled. Expression of VEGF mRNA were detected with RT-PCR. Result Compared with control group， expression of VEGF mRNA in low and high-dose admission groups of TBL both decreased (P&<0.05). Conclusion Expression of VEGF mRNA can be decreased by TBL， so the proliferation of the synovial pannus can be alleviated by inhibition of VEGF expression.
Key words：Tongbiling；rheumatoid arthritis；synovial cell；vascular endothelial growth factor
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以损害全身多关节特别是四肢小关节为主的慢性自身免疫性疾病，主要表现为慢性、对称性、进行性多关节炎，其典型的病理特征为炎症滑膜增生、单核细胞浸润和新生血管形成。关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节，最终导致关节畸形和功能丧失。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最有力的血管生成因子，在RA病理过程中起着关键作用[1-2]。本实验就其对体外培养RA患者膝关节滑膜细胞VEGF基因水平的影响进行研究，进一步明确通痹灵对血管新生的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
通痹灵浸膏(由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄等10味中药组成，广州中医药大学热带病研究所植物化学分析室提取，每克浸膏相当于原药材3.45 g)，DMEM(美国GIBCO公司生产)。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，杭州四季青公司生产)，胶原酶、胰蛋白酶、焦碳酸二乙酯(diethylpyrc arbonate，DEPC，美国GIBCO公司生产)，PCR marker(北京鼎国生物技术发展中心)，RT-PCR通用试剂盒及β-Actin引物(大连宝生物工程有限公司)，Primer软件设计及VEGF基因扩增引物(赛百胜公司)。CO2恒温培养箱(德国HERAEUS公司生产)，倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本OLYMPUS公司生产)，超净工作台(苏州净化设备厂生产)，核酸蛋白成像仪(Pharmacia公司)，核酸蛋白分析仪(Beckman公司)，电泳仪及水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)，PCR仪(美国PERKIN EIMER公司)，低温高速离心机(SIGMA公司)，常温低速离心机(北京医用离心机厂)，分光光度计(Beckman公司)，电转仪(美国Bio-Rad公司)。
1.2 类风湿关节炎患者滑膜细胞的分离提取及培养
RA患者肿胀的膝关节行关节腔镜手术取滑膜组织。将所取标本倒入玻璃皿中，用Hanks液洗涤3次，用眼科剪反复剪碎组织约2～3 mm2大小，加入含10%胎牛血清的DMEM和0.2%胶原酶(终浓度为0.2%)，移入75 cm2培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中消化10 min；反复吹打后移入离心管，1 000 r/min离心10 min；弃去上清液，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM吹打终止消化；用200目钢网过滤后1 000 r/min离心10 min，去上清液，加入含10%的DMEM 2 mL吹打均匀，移入75 cm2培养瓶中于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，观察细胞生长情况。生长3 d后细胞生长良好，长满培养瓶，消化分瓶，定时观察换液，长到一定数量后冻存部分细胞保证以后备用，剩余部分维持培养，取7～10代用于实验，每瓶待细胞长至约0.8×107时施加作用因素。空白对照组：含生理盐水＋10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵低剂量组：1.5 μg/mL通痹灵＋10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵高剂量组：150 μg/mL通痹灵＋10%胎牛血清的DMEM培养。待施加因素后培养72 h，细胞生长至107时进行裂解细胞提取总RNA。
1.3 总RNA提取
取培养的滑膜细胞消化离心，用PBS洗涤3次，加入0.8 mL RNAsol完全裂解细胞，转移裂解液至1.5 mL EP管中，加入80 μL氯仿，水平震动10 s，冰浴5 min，40 ℃低温离心机10 000 r/min离心20 min，吸取上清液移至另一EP管中，加入等量异丙醇完全混合后冰浴20 min，40 ℃低温离心机10 000 r/min离心20 min，去上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀物，小心倒去乙醇，自然风干10～15 min，加入适量DEPC h3O溶解。
1.4 RNA样品鉴定
①电泳：取RNA样品5 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳可见3条电泳带(见图1)；②吸取5 μL入核酸和蛋白分析仪的吸光度测量管，测λ＝260 nm吸光度(管中另加DEPC h3O补至1 mL，等于稀释200倍)。取2 μL做反转录反应。
1.5 反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)
反应利用PCR扩增仪进行。①RT反应合成cDNA：取5 μL总RNA加热70 ℃ 5 min，以破坏其二级结构；在20 μL反转录反应体系中进行，1 μL AMV反转录酶、2 μL总RNA、2 μL dNTP、4 μL MgCl2、2 μL 10-RT Buffer、7.5 μL DEPC h3O、0.5 μL RNase Inhibbtor、1 μL Random 9 mers；30 ℃反应10 min，40 ℃反应30 min，99 ℃变性5 min，5 ℃ 5 min。②PCR反应：在50 μL反转录反应体系中进行，8 μL cDNA、1 μL VEGF引物(正、反向引物各0.5 μL)、0.25 μL TakaRa Ex TaqHs、10 μL 5×PCR Buffer、28.75 μL DEPC h3O、2 μL β-Actin；VEGF引物：上游引物5’-GTG CGA GCA GCG AAA GCG C-3’，下游引物3’-CGA CAA GAG CGA AGC CGA A-5’；β-actin：上游引物5’- GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，下游引物5’-CTG GAA GGT GGA CAG TGA G-3’，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s， 35个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。
1.6 DNA琼脂糖凝胶电泳
配制1%琼脂糖凝胶，内含0.5 μg/mL的溴化乙锭，电压设定为100 V；加入10 μL靶基因与2 μL DNA Buffer混合液上样进行电泳40 min。
1.7 电泳条带测定及成像
电泳条带用凝胶成像系统拍照并进行电泳条带光密度分析，以VEGF标本靶基因条带光密度参数与内参基因(β-Actin)条带的光密度参数之比值作为该标本VEGF mRNA的表达水平参数。
1.8 统计学方法
采用SPSS11.0 for Window统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 反转录多聚酶链式反应结果
我们设计的VEGF引物可以检测到的主要是VEGF165，结果表明该细胞系表达的以VEGF165为主，经RT-PCR扩增后的VEGF165为528 bp，经电泳检测，VEGF条带清晰可见，β-actin为759 bp，其条带清晰可见，无杂带出现(见图2)。
2.2 半定量结果
电泳图像分析扫描仪扫描电泳条带得到VEGF与β-Actin条带各自的峰面积积分值，计算各样品的VEGF与β-Actin的比值。结果见表1。表1 通痹灵作用于RA滑膜细胞后VEGF mRNA的表达(略)
3 讨论
近年来的研究表明，VEGF在RA病理过程中起着关键作用，尤其在RA早期滑膜血管翳形成过程中，VEGF通过与其受体结合发挥生物学作用[3]，可增加血管通透性，提高炎性渗透，促进内皮细胞生长、迁移和新生血管形成[4]。RA的滑膜和滑膜液中富含VEGF，滑膜及滑膜液的VEGF表达有助于血管的渗透和血管新生[5]。
前期的大量研究已经证实，通痹灵对多种细胞因子有明显的干预作用，其中对CIA大鼠滑膜VEGF有明显抑制作用[6]。本实验应用通痹灵作用于体外培养的RA滑膜细胞，结果显示，其高、低剂量组对VEGF mRNA的表达较空白对照组均明显降低(P＜0.05)，表明通痹灵可抑制VEGF mRNA表达。结合前期实验研究结果可以看出，通痹灵在VEGF蛋白及基因表达两个水平均可起到下调作用，但究竟是二者同时抑制还是通过抑制基因表达从而阻断翻译过程的进行，或者通过阻抑其他调节VEGF表达的因子而起到作用尚不得而知，仍需进一步研究。然而，该药物临床上治疗RA疗效明显，能够在多个环节、多个靶点起到调节作用。本实验旨在探讨通痹灵在血管内皮细胞有丝分裂增殖、血管新生和血管翳形成等机制中所表现的作用，推测通过抑制VEGF及其基因表达减少、滑膜新生血管的形成，乃至骨质侵蚀破坏、血管通透性增高、炎性物质外渗等一系列病理环节中起到阻抑作用可能是其作用机制之一。
参考文献
[1] T Pufe， W Petersen， B Tillmann， et al. Splice variants VEGF121 and VEGF165 of the angiogenic peptide vascular endothelial cell growth factor are expressed in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis[J]. J Rheumatol，2001，28(7)：1482－1485.
[2] M Harada， K Mitsuyama， H Yoshid， et al. Vascular endothelial growth factor in patients with rheumatoid arthritis[J]. Scand J Rheumatol，1998，27(5)：377－380.
[3] Zeng H， Dvorak HF， Mukhopadhyay D. Vascular permeability factor(VPF)/vascular endothelial growth factor(VEGF) receptor-1 down-modulates VPF/VEGF receptor-2-mediated endothelial cell proliferation， but not migration， through phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathways[J]. J Biol Chem，2001，276：26969－26979.
[4] Senger DR， Gaci SS， Dvorak AM， et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid[J]. Science，1983，219：983－985.
[5] Nagashima M， Yoshino S， Ishiwata， et al. The role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis of rheumatoid arthritis[J]. J rheumatol，1995，22：1624－1630.
[6] 陈纪藩，刘清平，陈光星，等.通痹灵对胶原诱导型关节炎大鼠滑膜组织血管内皮生长因子表达水平的影响[J].广州中医药大学学报，2003， 20(1)：4－6.