作者：赵文君，樊秦，孙少伯，聂蕾
【摘要】 目的 探讨甘肃产华中五味子对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法 采用血清药理学方法，对体外培养的大鼠成骨细胞以MTT法进行细胞增殖测定、以PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性、以茜素红染色进行矿化结节计数。结果 培养48 h的10%、15%和培养72 h的5%、10%华中五味子75%醇提取物血清组的细胞增殖速度较对照组快(P＜0.05或P＜0.01)；培养48 h的10%、15%和培养72 h的10%华中五味子75%醇提取物血清组的ALP活性较对照组增加(P＜0.05)；培养2周的矿化结节计数显示，10%华中五味子75%醇提取物血清组多于对照组(P＜0.01)。结论 甘肃产华中五味子75%醇提取物对体外大鼠成骨细胞的增殖和分化具有促进作用。
【关键词】 华中五味子；血清药理学；成骨细胞；大鼠
Abstract：Objective To explore the effect of Schisandrae Sphenantherae on proliferation and differentiation of rat osteoblast in vitro. Methods Using the method of serum pharmacology， osteoblast was isolated from calvaria of newborn SD rats by means of modified sequential collagenase digestion and incubated in RPMI 1640 medium. The cell morphology was observed under a phase contrast inverted microscope. MTT assay， ALP activity， mineral node count were detected to determine the status and activities of proliferation and differentiation. Results In 10%， 15% concentration groups after cultured 48 h and 5%， 10% after cultured 72 h， 75% ethanol extracts of Schisandrae Sphenantherae significantly stimulated the proliferation (P＜0.05 or P＜0.01). In 10%， 15% concentration groups after cultured 48 h and 10% after cultured 72 h， ALP activity was increased (P＜0.05). In 10% concentration group， 75% ethanol extracts of Schisandrae Sphenantherae increased the number of mineral nodes after cultured 2 w (P＜0.01). Conclusion 75% ethanol extracts of Schisandrae Sphenantherae had positive effect on proliferation and differentiation of rat osteoblasts in vitro.
Key words：Schisandrae Sphenantherae；serum pharmacology；osteoblast；rat
甘肃产华中五味子为木兰科植物华中五味子的干燥成熟果实，其商品名习称西五味子，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效。本实验从华中五味子具有补肾的功能出发，根据中药调节骨代谢作用与中医“肾主骨”的理论，采用中药血清药理学的方法，从细胞水平探讨甘肃产华中五味子对大鼠成骨细胞增殖分化的影响，对甘肃产道地华中五味子治疗作用进行进一步研究，并为其临床治疗及其新剂型的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SD大鼠，雄性，体重(250±10)g，用于制备中药含药血清和空白对照血清；新生48 h SD大鼠，用于细胞培养取材，甘肃中医学院科研实验中心提供，合格证号：SCXY(甘)2004- 2006。
1.2 仪器
二氧化碳培养箱(型号：MCO-15AC，日本)，倒置显微镜
(OLYMPUS TH4-200，日本)，酶联免疫分析仪(美国)，生物安全柜(型号：HFsafe 760s)。
1.3 试剂
DMEM培养基购于Gibico公司，透明质酸酶、MTT均购于Sigma公司，碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购于北京中生生物公司，试剂RPMI 1640培养基(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Difco公司)。
1.4 药物
甘肃产华中五味子75%醇提物的制备：甘肃产道地华中五味子400 g，75%乙醇回流提取2次，每次1 h，过滤，收集2次的滤液，合并，浓缩至每1 mL相当于4.0 g原药材。
1.5 分组及含药血清的制备
参考文献
[1]制备。SD大鼠，雄性，共15只，按体重随机分为2组，即生理盐水组、华中五味子75%醇提物组，每日灌胃给药2次，每次1 mL/100 g，第3日给药后1 h，取血，采集到的血液静置4 h，3 000 r/min离心15 min，收集血清，56 ℃水浴灭活补体，-70 ℃保存。 1.6 成骨细胞的原代培养
参考文献
[2]方法，取新生48 h的SD大鼠，扼颈窒息致死，75%酒精消毒3 min，PBS冲洗，无菌下取头盖骨，刮除骨膜，再用PBS漂洗后剪成1 mm2大小的骨片，置0.25%胰蛋白酶中消化15 min，每3 min振荡1次，弃消化液，加0.1%Ⅱ型胶原酶在37 ℃下消化60 min，每5 min振荡1次，然后用细胞筛过滤，消化液离心(1 000 r/min、10 min)，收集细胞，接种在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液的培养瓶中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内，24 h换液。1.7 成骨细胞鉴定
OLYMPUS倒置相差显微镜作成骨细胞和矿化结节的形态学观察，ALP组织化学染色和茜素红矿化结节染色。
1.8 成骨细胞增殖测定
取第3代传代细胞，按4×104个/mL细胞密度，每孔200 μL接种于96孔培养板，待细胞贴壁后，换含药血清和对照血清培养液。按培养液所含血清浓度，设5%、10%、15% 3个浓度组，5孔重复，分别培养24、48、72 h。在培养结束前4 h，每孔各加MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃温育4 h后弃培养液，加DMSO 200 μL，用微量振荡器振荡10 min，在酶标仪上测OD值，波长为570 nm。
1.9 成骨细胞碱性磷酸酶活性测定
细胞培养及分组同成骨细胞增殖测定项。于培养24、48、72 h后，弃上清液，PBS洗3次，然后每孔加入0.1% Triton X-100 50 μL，置4 ℃冰箱过夜。采用磷酸对硝基苯酯(PNPP)二钠盐法，每孔加入ALP检测试剂盒中新配置的底物100 μL，37 ℃温箱内30 min，最后加0.1 mol/L NaOH 100 μL终止反应，用酶标仪于405 nm波长处测OD值。
1.10 成骨细胞矿化结节计数
取第3代传代细胞，按4×104个/mL细胞密度，每孔500 μL接种于24孔板，待细胞贴壁后，换含药血清培养液和对照血清培养液。按培养液所含的血清浓度，设5%、10%、15% 3个浓度组，4孔重复，培养2 周。弃培养液，PBS冲洗后95%酒精固定10 min，0.1%茜素红溶液染色30 min，蒸馏水冲洗，晾干，以橘红色结节、边界清晰、短径＞200 μm为标准，低倍镜下进行计数。
1.11 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行统计。数据采用x±s表示，组间差异采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 形态学观察
成骨细胞鉴定显示，细胞呈梭形、三角形及多突起状，在Wright-Giemsa染色中，细胞核为紫红色，胞质呈淡兰色。矿化结节由较多成骨细胞集聚而成，通过分泌基质，经钙化后形成结节样团块。
2.2 成骨细胞增殖的测定
(见表1)表1 华中五味子75%醇提物对大鼠成骨细胞增殖的影响(略)注：与同一血清浓度对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01(下同)
2.3 成骨细胞碱性磷酸酶的测定
(见表2) 表2 华中五味子75%醇提物对大鼠成骨细胞ALP活性的影响(略)
2.4 成骨细胞矿化结节计数
(见表3)表3 华中五味子75%醇提物对大鼠成骨细胞矿化结节计数的影响(略)
骨质疏松症是以骨量减少为主的全身系统性疾病。随着年龄的增加，相对骨吸收大于骨形成，而导致骨量的减少，引起骨质疏松[3]。成骨细胞是骨转换过程中的主要功能细胞，能分泌类骨质，促进骨形成。通过成骨细胞系找到能促进骨形成的物质是开发骨质疏松症治疗药物的主要手段之一。
本实验结果显示，与正常大鼠血清相比，华中五味子75%醇提物不同浓度含药血清均可增高成骨细胞增殖率，以10%、15%含药血清组的作用较为明显，5%含药血清组在72 h时明显；10%、15%含药血清组培养48 h，10%含药血清组培养72 h后，ALP活性增强；华中五味子75%醇提物10%含药血清组矿化结节数量显著多于对照组(P＜0.01)。结果表明，甘肃产华中五味子75%醇提物不仅有刺激成骨细胞增殖作用，对ALP活性和矿化结节形成也有较好刺激作用。说明在促进细胞增殖的同时，也能促进细胞进一步分化成熟，因而可提高成骨细胞骨形成的功能。这对于进一步研究开发华中五味子的药理作用以及对临床的用药指导都具有重要意义。
参考文献
[1] 王力倩，李仪奎，符胜光，等.血清药理学方法研究与探索[J].中药药理与临床，1997，13(3)：29－31.
[2] 王 前，钟世镇，龚文汇，等.鼠颅盖骨成骨细胞体外培养及ALP免疫组化法鉴别纯化[J].中华骨科杂志，1995，15(6)：364－366.
[3] Riggs BL. Melton LJ. Involutional osteoporosis. NEngl[J]. Med. 1986，314：1676－1670.