作者：马丽君，苗珍花，马伟，田建英
【摘要】 目的 观察阿魏酸和芍药苷混合剂对FeSO4和h3O2诱导的PC12细胞损伤的影响，初步探讨其作用机制。方法 采用FeSO4和h3O2作用产生自由基的方法诱导建立PC12细胞损伤模型。倒置相差显微镜进行细胞形态学观察；采用MTT比色分析测定细胞存活率；硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与FeSO4和h3O2损伤组进行比较，阿魏酸和芍药苷的混合剂能明显改善PC12细胞的存活数量，降低MDA的含量和提高SOD活性。结论 浓度为5～50 μmol/L的阿魏酸和浓度为1～10 μmol/L的芍药苷混合剂对FeSO4和h3O2诱导PC12细胞损伤有明显的保护作用，其作用机制可能与阿魏酸和芍药苷清除自由基和抑制脂质过氧化有关。
【关键词】 阿魏酸；芍药苷；PC12细胞
Abstract：Objective To observe the protective effects of the mixture of ferulic acid (AF) and paeoniflorin on PC12 cells injury by FeSO4/h3O2 in vitro， and explorer its mechanism. Methods The cell injury model was established with FeSO4/h3O2 for 24 h. The process of the growth and morphology of the cells were observed under phase contrast microscope in vitro. The survival rate of the cells was determined by MTT method. The content of MDA and SOD activity was measured respectively by thiobarbituric acid and xanthine oxidase method. Results Compared with FeSO4/h3O2， the mixture of ferulic acid (AF) and paeoniflorin enhanced the PC12 cells survival rate and viability， reduced MDA content and increased SOD activity. Conclusion The mixture of 5～50 μmol/L AF and 1～10 μmol/L paeoniflorin exerted protective effects on PC12 cells injury induced by FeSO4/h3O2， which maybe related to free radical scavenging activity and lipid peroxidation process being inhibited.
Key words：ferulic acid；paeoniflorin；PC12 cells
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病之一，是造成痴呆的最常见原因。AD病因为多因素参与，发病机制尚不完全清楚，近年研究发现，氧化损伤所造成的神经元凋亡是造成AD的重要原因之一[1]。过氧化氢(h3O2)是活性氧族(ROS)的主要成分之一，可通过细胞膜与细胞内的铁反应产生OH，广泛用于诱导细胞损伤模型的建立。阿魏酸和芍药苷源于古方当归芍药散中当归、白芍的主要单体成分，有文献报道，白芍、当归及其活性成分具有调节机体免疫功能，影响下丘脑、松果体的功能及抗衰老自由基等作用[2-4]。PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤，用于神经细胞死亡方式及神经毒方面的研究[5]。本实验采用FeSO4和h3O2诱导PC12细胞损伤，观察阿魏酸和芍药苷混合剂对PC12细胞的保护作用，并对其作用机制进行初步探讨。现将研究结果报道如下。
1 实验材料
1.1 药物及主要试剂
阿魏酸、芍药苷(中国药品生物制品鉴定所)；DMEM培养基、新生小牛血清、胰蛋白酶均购于Gibco公司；MTT、多聚赖氨酸购于Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程公司。
1.2 细胞株
PC12细胞购于中国科学院上海细胞所。
1.3 主要仪器
302型二氧化碳孵育箱(美国，SHELLAB)，721型分光光度计(上海)，倒置相差显微镜(Nikon)，Anke LXJ-ⅡB型离心机，精密电子天平，550型酶标仪。
2 实验方法
2.1 体外细胞的培养
PC12细胞，用10%小牛血清，青-链霉素各10万U的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，3 d换液，每周传代1次。
2.2 分组及给药
取对数生长期的PC12细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于预先包被多聚赖氨酸的96(0.2 mL/孔)孔板中，孵育24 h后进行实验。实验分成空白对照组、维生素E组、FeSO4和h3O2损伤组(FR组)、阿魏酸＋芍药苷组、维生素E＋FR组、阿魏酸＋芍药苷＋FR组。空白对照组换10%小牛血清的DMEM液培养，实验组分别加入20 μmol/L维生素E；1～50 μmol/L阿魏酸、0.1～10 μmol/L芍药苷混合剂于37 ℃、5%CO2培养箱中预先孵育24 h，加入终浓度为100 μmol/L FeSO4和50 μmol/L h3O2进行损伤处理[6]。24 h后观察各检测指标。
2.3 光镜观察
在倒置相差显微镜下观察PC12细胞损伤前后形态学改变。
2.4 细胞存活率测定
在原液中加入5 g/L MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入100 μL二甲基亚砜，室温下振荡10 min，待镜下观察紫色结晶全部溶解后，用ELISA读数仪测定MTT的OD值，检测波长490 nm。无细胞含培养液的培养孔调零。
2.5 超氧化物歧化酶、丙二醛检测
取细胞培养液，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性；硫代巴比妥酸法测定MDA含量。
3 统计学方法
用SPSS11.5统计软件，各实验数据以x±s表示，采用方差分析、配对t检验。
4 结果
4.1 形态学观察
在倒置相差显微镜下观察，刚分离接种的细胞呈圆形、透亮；培养3 d后，贴壁的活细胞开始长出突起；加入FeSO4和h3O2损伤处理24 h，可见大部分细胞胞体破裂，突起断裂，残存的细胞折光性下降，具有完整结构的细胞数量减少；预先给予阿魏酸和芍药苷的混合剂培养24 h，加入FeSO4和h3O2进行损伤，发现死亡细胞有所减少，许多突起仍然成网络连接。
4.2 阿魏酸、芍药苷混合剂对FeSO4和h3O2诱导损伤PC12细胞活力的影响
(见表1)表1 阿魏酸、芍药苷混合剂对FeSO4和h3O2诱导损伤PCl2细胞活力的影响(略)注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与FR组比较，#P＜0.05，##P＜0.01(下同)
4.3 阿魏酸、芍药苷混合剂对FeSO4和h3O2诱导损伤PC12细胞中超氧化物歧化酶、丙二醛的影响
(见表2)表2 阿魏酸、芍药苷混合剂对FeSO4和h3O2诱导损伤PCl2细胞SOD、 MDA的影响(略)
5 讨论
本实验应用FeSO4和h3O2相互作用产生羟自由基，诱导PC12细胞损伤24 h后，细胞形态学发生改变，可见具有完整细胞结构的细胞数目减少，大部分细胞胞体破裂、突起断裂，细胞活力下降，MDA的水平升高，SOD活性降低，与孙氏等[7]研究结果是一致的。铁是细胞色素蛋白中血红素的关键成分，在细胞呼吸过程中介导线粒体内的电子传递，所以，铁代谢对脑组织的正常功能活动极为重要。另外，铁还参与了与儿茶酚胺代谢有关的酪氨酸羟化酶和单胺氧化酶的构成，是脑内许多独特的酶系统的辅助因子。然而，高浓度的游离铁离子存在于细胞内或细胞周围却是非常有害的。铁离子特别是二价铁离子能与细胞内的某些分子一起参与氧化还原反应，作为电子供体催化自由基的生成，使线粒体电子传递系统受损、胞内钙平衡紊乱、蛋白酶作用加强、膜脂质过氧化反应增强，最后导致细胞死亡[8]。
阿魏酸是一种抗氧化剂，其分子结构苯环上的羟基是抗氧化活性基团；阿魏酸还能与膜磷脂酰乙醇胺结合，保护膜脂质不受氧化。芍药苷对细胞缺血样损伤具有保护作用。在一定浓度范围内，阿魏酸、芍药苷混合剂可明显增加PC12细胞的数量和细胞活力，降低MDA含量和提高SOD活性。维生素E作为抗氧化剂可抑制生物膜的过氧化反应，直接清除自由基，减少自由基介导的神经细胞损伤。本实验结果显示，维生素E处理后可提高神经细胞的活力，降低MDA含量，提高SOD活性。阿魏酸＋芍药苷＋FR组与维生素E＋FR组的OD值及SOD、MDA相比，P＞0.05，提示一定浓度范围的阿魏酸、芍药苷混和剂与维生素E有相似的抗氧化作用，即阿魏酸和芍药苷具有较强的清除自由基、抑制脂质过氧化的抗氧化效应，值得进一步研究和探讨。
参考文献
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