作者：李凌，徐雪明，李春来，程学新，万福生
【摘要】 目的 通过BALB/C小鼠皮下接种肝癌h32细胞建立移植瘤模型，采用半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合反应停治疗小鼠肝癌，探讨两药联合对肝癌移植瘤的抑制作用。方法 体外培养小鼠肝癌h32细胞，取对数生长期细胞试验。乙醇回流提取半枝莲。接种h32细胞于BALB/C小鼠皮下建立肝癌h32的移植瘤模型。28只雄性BALB/C小鼠随机分为4组，每组7只。A组：反应停灌胃；B组：半枝莲乙醇提取液瘤内注射；C组：半枝莲乙醇提取液、反应停联合用药；D组：1%乙醇0.2～0.5 mL瘤内注射。观察肿瘤大小和瘤重，比较抑瘤效果。移植瘤采用抗CD31单抗做免疫组化染色，测定移植瘤组织微血管密度(MVD)。结果 A、C组之间瘤重差异有统计学意义(P＜0.01)，B、C组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。A、B、C 组抑瘤率分别为18.11%、53.15% 和71.65%；协同系数0.74。3个治疗对照组之间微血管计数比较差异有统计学意义(P＜0.01)，SNK-q检验显示A组和B组之间差异不明显(P＞0.05)，A、B组分别与C组比较差异有统计学意义。结论 半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合应用反应停对小鼠h32肝癌移植瘤有较强的抑制作用。半枝莲和反应停均有抗血管生成作用，两药联用对肿瘤微血管生成的抑制有协同作用。
【关键词】 半枝莲；反应停；肝肿瘤；抗血管生成；动物模型
Abstract：Objective BALB/C mice were inoculated subcutaneously with hepatoma 22 (h32) cells， and the treatment effect of thalidomide and intratumor injection of ethanol extract of Scutellaria Barbata (SB) on tumor growth were evaluated. Methods In vitro， mouse h32 liver cells were cultivated， and h32 cells in the logarithmic growth phase were tested. SB was extracted in the ethanol recirculation. A total of 28 BALB/C male mice inoculated subcutaneously with h32 cells were randomly pided into 4 groups， 7 mice per group. Group A：intragastric administration with thalidomide. Group B：SB intratumor injection. Group C：combination of thalidomide and SB with the same administration as Group A and Group B. Group D (control group)：1% Ethanol 0.2～0.5 mL intratumor injection. Tumor volumes of four groups were observed and the tumors were weighed. The microvessel densities (MVD) of all transplantation tumors were measured by immunohistochemical staining with anti-CD31 monoclonal antibody. Results There were statistically significant differences between Group C and Group A (P＜0.01)， or Group B (P＜0.05). The cooperative coefficient was 0.74， meanwhile the inhibititory rates of Group A， B and C were 18.11%， 53.15% and 71.65%， respectively. Measurement of Microvessel Count：There were Statistically significant differences among the treated groups and the control group D (P＜0.01)， no statistically significant differences between group A and B (P＞0.05). The studies showed statistically differences between Group C and Group A (P＜0.05)， and between Group C and Group B (P＜0.01)， respectively. Conclusions The combinatation of intratumor SB injection and thalidomide elicited significant antitumor activities on the transplanted tumor model of h32. Anti-angiogenesis effects of SB and thalidomide was found， furthermore， the combination agent showed synergistic action of antiangiogenesis.
Key words：Scutellaria Barbata D.Don；thalidomide；hepatoma；antiangiogenesis；annimal model
动物可移植性肿瘤是目前国内外肿瘤实验研究中最常用的一种模型。小鼠移植性肝癌模型h32作为对药物进行临床验证的“筛选系统”已证明是有效的[1]。本实验将半枝莲与反应停联合应用，通过建立BALB/C小鼠皮下接种肝癌h32细胞建立移植癌模型来探讨其抑瘤效果；采用抗CD31单抗做免疫组化染色，测定移植瘤组织微血管密度(MVD)，探讨半枝莲和反应停联合用药的抗肿瘤血管生成作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
h32细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640(GIBCO公司)培养液中，置于CO2浓度为5%、相对湿度为95%、温度为37 ℃的细胞培养箱中培养。细胞传代后培养48、96 h的贴壁细胞为对数生长期细胞，取传代后48 h细胞。
1.2 半枝莲乙醇提取液的制备
用半枝莲干品50 g，采用4倍量的70%乙醇加热回流提取3次，每次1 h。120目网筛过滤弃药渣，用干燥滤器过滤，取滤液25 mL，用旋转蒸发仪蒸干后，105 ℃干燥3 h，冷却30 min，称取干燥品重量，所得重量/25 mL即为半枝莲乙醇提取液。将剩余滤液调整pH值至7.0～7.2后于-20 ℃保存备用。
1.3 造模
采用BALB/C小鼠，5周龄左右，雄性，体重(17±2.19)g。记录接种前每只小鼠体重。接种对数生长期h32细胞于小鼠右侧腹股沟皮下，接种量约6.0×106/只。28只BALB/C小鼠接种后完全随机分为4组，每组7只。反应停组(A组)自接种第1日起，反应停50 mg/kg灌胃D1-12；半枝莲乙醇提取液瘤内注射组(B组)半枝莲乙醇提取液1 g/mL 0.2～0.5 mL瘤内注射D6，8， 10，12；联合用药组(C组)同时采用A组与B组的给药方法；对照组(D组)自接种第6日起，1%乙醇0.2～0.5 mL瘤内注射D6，8，10，12。自接种第4日起每日测量小鼠右侧腹股沟皮下移植瘤大小。瘤体体积＝π/4×a×b2(a为长径，b为短径)。接种第12日，小鼠称重后脱颈髓处死荷瘤小鼠，剥离瘤体后称取瘤重。抑瘤率＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100%；协同系数＝对照组瘤重×联合用药组瘤重/(单药组①瘤重×单药组②瘤重)；当抑瘤率＞40%，P＜0.05判定有抗肿瘤作用；当协同系数＜1时为有协同性。
1.4 免疫组化测定瘤体血管密度
移植瘤采用抗CD31单抗做免疫组化染色，测定移植瘤组织MVD。参照文献[2]方法，在低倍镜下选取5个MVD最高的区域，10×25倍放大的视野下，每一个着染的单个内皮细胞或细胞串计为1个微血管，血细胞和大的血管腔不计。
1.5 统计学方法
所有数据均用x±s表示，采用Microsoft excel软件对数据做统计学处理，采用方差分析。
2 结果
(见表1)表1 半枝莲乙醇提取液与反应停对h32移植瘤的影响(略)注：与D组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
3 讨论
Caspases是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase) 的简称，在细胞凋亡的信号通路中，Caspase-3，7是处于核心地位的效应分子，其酶原能够被Caspase-8和Caspase-9激活，最终导致细胞凋亡。2006年，Judy Yuet-Wa Chan等[3]研究发现，半枝莲中分离的脱镁叶绿甲酯酸(pheophorbidea，C35H36N4O5)可通过抑制Bcl-2基因，DNA断裂，阻滞细胞周期，释放细胞色素C进入胞质和激活Caspases-3、Caspases-9等机制诱导肝癌Hep3B凋亡。本实验采用半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合反应停治疗h32移植瘤，联合用药组瘤重明显小于对照组(P＜0.01)。其具体的抗肿瘤作用机制值得进一步探讨。
血管形成是肿瘤生长、转移、复发的关键环节，是瘤细胞诱导毛细血管形成而建立血液循环的过程。D’Amato等[4]进行家兔角膜微袋分析研究后，发现反应停能抑制由bFGF诱导的血管生成。Kenyon等[5]在小鼠试验中证实，反应停能有效抑制由bFGF和VEGF诱导的角膜血管生成。适量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)是机体免疫防护的重要介质，而过量的TNF-α可影响宿主的免疫状态，造成体重下降、恶液质、免疫应答改变和贫血等。在许多恶性肿瘤中，TNF-α表达过高。在反应停生物活性中，最确切的就是其对很多恶性肿瘤中过多表达的TNF-α的抑制作用[6]。Rowland等[7]通过RT-PCR研究证实了反应停诱导TNF-α的mRNA的降解从而选择性的抑制了TNF-α的表达。
本研究采用小剂量反应停(50 mg/kg)联合半枝莲乙醇提取液瘤内注射治疗小鼠移植瘤，观察到反应停组和半枝莲乙醇提取液组均有抗肿瘤血管生成作用，且两药联合有协同作用。虽然反应停组瘤重小于对照组，差异无统计学意义，但是反应停和半枝莲联合用药对h32移植瘤有显著的抑制作用，其具体机制值得进一步研究。BALB/C小鼠肝癌移植模型周期较短，肿瘤的大小和位置较易控制，与人肝癌有所不同。因此，已在移植瘤模型上取得的初步结果是否与人体一致还需进一步验证。
参考文献
[1] 李海燕，方肇勤，梁尚华.小鼠移植性肝癌(h32)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用[J].中国中医基础医学杂志，2000，6(1)：27－30.
[2] Tjalma W， Van Marck E， Weyler J， et al. Quantification and prognostic relevance of angiogenic parameters in invasive cervical cancer[J]. Br J Cancer，1998，78(2)：170－174.
[3] Judy Yuet-Wa Chan， Patrick Ming-Kuen Tang. Pheophorbide a， a major antitumor component purified from scutellaria Barbata， induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Plant Med，2006，72(1)：28－33.
[4] D’Amato RJ， Loughnan MS， Flynn E， et al. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(9)：4082－4085.
[5] Kenyon BM， Browne F， D Amato RJ. Effects of thalidomide and related metabolites in a mouse corneal model of neovascularization[J]. Exp Eye Res，1997，64(6)：971－978.
[6] Thomas DA， Kantarjian HM.The revitalization of thalidomide[J]. Ann Oncol，2001，12(7)：885－886.
[7] Rowland TL， McHugh SM， Deighton J， et al. Differential regulation by thalidomide and dexamethasone of cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells[J]. Immunopharmacology， 1998， 40(1)：11－20.