作者：曹丽，杨卫彬，潘瑞乐，李玲玲，金文，孙虹，孙晓波
【摘要】 目的 观察升麻总苷对小鼠移植性肿瘤和人肿瘤细胞裸鼠移植瘤的体内抗肿瘤作用，以及体外对人肿瘤细胞株的抑瘤活性，并对其抑瘤机制进行初步探讨。方法 MTT法检测体外升麻总苷对人肿瘤细胞的增殖抑制作用；体内实验观察其对小鼠S180和裸鼠体内移植人肺腺癌A549的抑制作用；同时采用流式细胞仪和肿瘤病理切片对接种的A549肿瘤细胞凋亡进行观察。结果 升麻总苷对A549、HepG2、HL60、Eca-109、MDA-MB231肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为20.3、27.1、21.2、23.4和32.7 μg/mL。小鼠口服升麻总苷100 mg/kg和200 mg/kg可明显抑制S180移植瘤(抑瘤率分别为42.8%和54.6%)和裸鼠移植人肺腺癌A549的生长(T/C值分别为58.1%和52.2%)，肿瘤组织病理切片和流式细胞仪对A549肿瘤细胞凋亡的检测显示，升麻提取物可诱导体内肿瘤细胞凋亡。结论 升麻体内体外均具有抗肿瘤活性，其体内抑制肿瘤生长可能与诱导细胞凋亡相关。
【关键词】 升麻总苷；小鼠S180肉瘤；裸鼠；人肺腺癌A549；凋亡
Key words：total glycoside of Cimicifuga dahurica；Sarcoma 180 tumor cells；nude mice；human pulmonary carcinoma A549；apoptosis
目前，肿瘤的化学治疗已经取得很大进展，许多癌症通过化学治疗得到缓解甚至治愈。但是，目前化疗药物仍存在毒副反应大以及肿瘤细胞对药物产生耐药等问题，因此，迫切需要开发新的高效、低毒的抗肿瘤药物。升麻具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功能，用于风热头痛、齿痛、口疮、咽喉肿痛、麻疹不透、阳毒发斑、脱肛、子宫脱垂等症[1]。2005年版《中华人民共和国药典》(一部)收载的升麻为毛茛科植物升麻(Cimicifuga foetida L.)、兴安升麻(C.dahurica Maxim.)和大三叶升麻(C．heracleifolia Kom.)的根茎。近年来对升麻药理活性的研究表明，升麻三萜类化合物体外具有明显的抗肿瘤细胞增殖作用[2-4]，口服升麻提取物可明显抑制小鼠肝癌h32的生长，升麻抗肿瘤活性与诱导肿瘤细胞凋亡相关[5]。为了进一步明确升麻的抗肿瘤活性，笔者采用兴安升麻总苷提取物对小鼠移植瘤及裸鼠体内移植人肿瘤细胞的影响进行观察，为升麻的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药物及试剂
兴安升麻总苷(TGCD)的制备：原材料于2004年9月采自内蒙古自治区喀喇沁旗茅荆坝，经鉴定为兴安升麻。将升麻地下部分粉碎过筛后，以10倍量的80%乙醇加热回流提取3次，每次1 h。提取完毕，过滤，滤液减压浓缩至波密度为1.12时加入吸附剂硅藻土进行柱层析。先以工业己烷洗去油脂，然后用乙酸乙酯洗脱，得到的乙酸乙酯部分经减压浓缩得总苷，收率为5%～6%，以27-脱氧升麻亭为对照品，比色法测定升麻总苷含量达60%。5-氟尿嘧啶(5-FU)为天津金耀氨基酸有限公司产品，批号0703021；环磷酰胺(CPX)为山西普德药业有限公司产品，批号20050604；紫杉醇为北京四环医药科技股份有限公司产品，批号0612181。培养基RPMI-1640、DMEM、MTT为Gibco公司产品，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.2 动物
ICR小鼠，雄性，18～22 g；BALB/c 品系裸鼠，雄性，16～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK (京)2007-0001。
1.3 细胞株
人肺腺癌细胞A549购自中国医学科学院肿瘤研究所，人食道癌细胞Eca-109购自中国科学院上海细胞中心，小鼠肉瘤S180购自北京大学医学部动物中心，人白血病细胞HL-60、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB231均由常规液氮保存。
1.4 升麻总苷体外抑瘤活性的测定
参照文献[6]方法，收集生长良好的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI- 1640或DMEM 培养基配成1×104/mL细胞悬液，接种于96孔板内，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2孵箱培养24 h后，加入待测TGCD药液(药物终浓度10、20、40、80、100、200 μg/mL)，每浓度设3个平行孔，实验设空白对照和阳性对照药孔。阳性对照药为5-FU(药物终浓度0.1、1、10 μg/mL)。培养4 d后弃上清，每孔加入MTT液10 μL(5 mg/mL，RPMI-1640培养基配制)后继续培养4 h，每孔加入100 μL酸化异丙醇细胞裂解液，过夜培养，用Bio-Tek MQX200型酶标仪在检测波长540 nm、参考波长450 nm下测吸光度(A)值，计算每个浓度抑制率和，用SPSS10.0统计软件计算出IC50值。
1.5 升麻总苷体内对小鼠S180移植性肿瘤的药效观察
取小鼠传代后第7～10日的肿瘤组织，研磨成细胞悬液，用无菌生理盐水稀释，细胞浓度为1×107/mL，于小鼠右前腋皮下接种，0.2 mL/只，接种全过程在无菌操作下完成。第2日分组给药，5组分别为模型对照组、阳性药对照组(腹腔注射CPX 30 mg/kg)及TGCD低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg)，阳性药对照组，每组10只。每天给药1次，共10 d。末次给药后24 h处死动物，称体重后完整剥离瘤块并称重，计算抑瘤率。
1.6 升麻总苷对裸鼠体内移植人肿瘤细胞的抑瘤作用
在超净台内无菌操作下取出在裸鼠体内生长良好的肿瘤结节，剪成1 mm3大小的小瘤块，采取套管针小块接种法，将瘤块埋植于BALB/c系裸鼠右腋窝皮下。待肿瘤长出并可触及时，将动物随机分为5组，每组6只，分别为模型对照组、阳性药对照组及TGCD低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg)。实验组每日灌胃TGCD悬液1次，连续给药18 d。阳性药对照组腹腔注射紫杉醇15 mg/kg，每周2次，给药期限同实验组。裸鼠饲养在室温20～22 ℃，相对湿度40%～60%，并具屏蔽系统辅以洁净层流柜的环境内。于实验开始后每周2次用卡尺测量肿瘤体积，绘出肿瘤生长曲线。末次给药结束后24 h，处死动物，称体重后完整剖取瘤块，分别以下式计算肿瘤体积和抑制肿瘤的T/C(%)值：
肿瘤体积(V)＝肿瘤长径×(肿瘤短径)2/2
T/C＝给药组平均肿瘤体积(T)/对照组平均肿瘤体积(C)×100%
抑瘤率(%)＝[1－给药组平均瘤重(T)/对照组平均瘤重(C)]×100%
1.7 升麻总苷对裸鼠移植瘤A549细胞凋亡的影响
称重移植瘤后，切取移植瘤组织约2 mm×2 mm×2 mm，研磨，离心，制成单细胞悬液，加入结合buffer调整细胞数为5×105/mL，取195 μL细胞重悬液，加5 μL AnnexinV/FITC，室温下混合，孵育10 min。加入200 μL结合buffer，清洗细胞，于4 ℃1 000 r/min离心10 min。弃上清，加入190 μL结合buffer，重悬细胞，加入10 μL浓度为20 mg/L的PI，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。其余移植瘤组织用4%中性甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，显微镜下观察细胞凋亡情况。
1.8 统计学方法
定量数据以x±sx±s表示，体内药效实验结果用Office Excel软件进行t检验，求P值，P＜0.05为差异有统计学意义。体外抑制肿瘤细胞的IC50值用SPSS10.0统计软件计算。
2 结果
2.1 升麻总苷对人肿瘤细胞增殖的抑制作用
TGCD对5种肿瘤细胞均有明显的抑制作用，对A549和HL-60的抑制效果最好，IC50值分别为20.3、21.2 μg/mL。结果见表1。表1 升麻总苷对人癌细胞株生长的抑制作用(略)
2.2 升麻总苷体内对裸鼠A549移植瘤的抑制作用
TGCD 100、200 mg/kg对A549细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率与模型对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，T/C值分别为58.1%和52.2%，均低于60%，表明其抗肿瘤是有效的，阳性药紫杉醇T/C值为47.9%，50 mg/kg的TGCD对A549抑瘤作用不明显。病理结果显示，模型对照组肿瘤细胞核大、核质比例大，细胞形态完整。紫杉醇组大部分肿瘤细胞核深染，细胞皱缩体积变小，显示明显的凋亡形态。TGCD 200 mg/kg组肿瘤组织出现大面积的细胞核深染，细胞皱缩体积变小等类似紫杉醇组肿瘤细胞样的凋亡形态，TGCD 100 mg/kg组同样出现一些明显的凋亡细胞，但数量少于紫杉醇组和TGCD 200 mg/kg组。
2.3 升麻总苷体内对小鼠S180移植性肿瘤的抑制作用
实验过程中，模型组有2只动物死亡、TGCD中、低剂量组各有1只动物死亡。TGCD对S180小鼠瘤株显示出较高的抑瘤率，中、高剂量TGCD(100 mg/kg，200 mg/kg)对S180抑瘤率分别为42.8%和54.6%。结果见表2。表2 升麻总苷对小鼠S180移植性肿瘤的抑制作用(略)注：与模型对照组比较，*P＜0.01，**P＜0.001(下同)
2.4 Annexin V/PI流式细胞仪测定升麻总苷体内对裸鼠A549移植瘤细胞的促凋亡作用
100 mg/kg和200 mg/kg的TGCD对裸鼠A549移植瘤细胞具有明显的促凋亡作用，凋亡细胞百分率分别为15.69%和25.55%。结果见表3。表3 TGCD 对A549肿瘤细胞抑瘤作用(略)
3 讨论
现代药理研究表明，升麻具有镇痛、镇静、抗炎等活性，对其三萜类皂苷成分的深入研究发现，其可有效缓解更年期骨质疏松，并具有明显的抗肿瘤作用[1-4]。
本研究结果表明，TGCD体外可明显抑制A549、HL-60等多种肿瘤细胞的增殖，其IC50值均低于35 μg/mL；体内可明显抑制S180肉瘤及裸鼠移植人肺癌A549的生长，其100、200 mg/kg剂量对S180的抑制率分别为42.8%、54.6%，与模型对照组相比差异有统计学意义；对移植人肺癌A549裸鼠的T/C值分别达到58.1%和52.2%，高剂量组与阳性药紫杉醇抑制作用接近，不同剂量组之间呈现明显的量效关系。
在抗肿瘤药物治疗过程中，细胞凋亡是一种重要机制，细胞凋亡的诱导与促凋亡基因激活及抗凋亡基因抑制有关，促凋亡基因功能衰退及抗凋亡基因功能增强都会诱导细胞凋亡。田氏等[3]研究发现，升麻地上部分提取物可通过升高Bax/Bcl-2的比值，活化caspase3以及抑制多聚聚合酶(PARP)的表达而诱导肝癌细胞HepG2的凋亡。本研究通过对裸鼠肿瘤组织病理切片观察可见，TGCD可导致肿瘤细胞出现凋亡形态，此改变与阳性药紫杉醇的作用相似；进一步采用Annexin V/PI流式细胞仪双标记法测得其对裸鼠接种人A549肿瘤细胞具有明显的诱导凋亡作用，提示兴安升麻总苷体内抑制肿瘤的活性与诱导肿瘤细胞凋亡相关。
已知的抗肿瘤药物的毒性是临床很棘手的问题，因此，从天然植物中发现新的高效低毒抗肿瘤药物是目前研究的热点。研究表明，升麻对正常肝细胞和肝癌细胞是有一定选择性的，并对肝癌耐药株也有明显抑制作用[6]，裸鼠移植人肺癌A549的生长实验表明，TGCD组动物体重没有阳性药物下降明显。而以升麻皂苷为主要成分的中药新药希明婷片作为国家“十五”863计划成果，临床用于妇女更年期疗效显著，没有明显的毒性反应，说明TGCD提取物的毒性较低，因此升麻有可能成为新的抗肿瘤中药。
参考文献
1] 刘 勇，陈迪华，斯建勇，等.升麻属植物的化学、药理与临床研究[J].国外医药·植物药分册，2001，16(2)：55－58.
[2] 田 泽，斯建勇，王 婷，等.24-O-乙酰升麻醇-3-O-β-D-木糖苷对HepG2细胞的细胞毒性及其作用机制[J].中国药学杂志，2007，42(7)：505－508.
[3] 田 泽，斯建勇，陈四保，等.23-O-乙酰升麻醇-3-O-β-D-木糖苷对HepG2细胞的细胞毒性及其作用机制[J].中国中药杂志，2006，31(21)：1818－1821.
[4] 田 泽，斯建勇，黄 锋，等.兴安升麻地上和地下部分总苷生物活性比较[J].中药材，2005，28(5)：372－374.
[5] Tian Z， Pan RL， Chang Q， et al. Cimicifuga foetida extract inhibits proliferation of hepatocellular cells via induction of cell cycle arrest and apoptosis[J]. J Ethnopharm，2007，114：227－233.
[6] 刘朝阳，王德昌，付招娣，等.参芪金康胶囊抗肿瘤作用的实验研究[J].癌症，2006，25(8)：983－989.