作者：郑格琳，张平，郭洁，程玲
【摘要】 目的 探讨补阳还五汤对体外培养的星形胶质细胞反应性增生的抑制作用。方法 分离培养新生Wistar大鼠脊髓的星形胶质细胞，将细胞培养皿随机分为补阳还五汤组和不加中药的空白对照组。用塑料吸头划刮培养皿，制造机械损伤的模型，继续培养至72 h，分别取出不同时间点的细胞进行胶质细胞增生情况的观察和免疫组织化学染色，对胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达产物光密度进行图像分析。结果 在划痕后2～48 h，补阳还五汤组星形胶质细胞增生比较轻微，GFAP表达与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 补阳还五汤可以抑制神经胶质细胞反应性增生，有利于改善损伤脊髓修复再生的微环境。
【关键词】 脊髓损伤；补阳还五汤；星形胶质细胞；胶质原纤维酸性蛋白
Key words：spinal cord injury；Buyang Huanwutang；astroglia cell；GFAP
脊髓损伤后，星形胶质细胞反应性增生，最终形成胶质瘢痕，并且高水平表达胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，这已经是一个多世纪以来公认的学说。我们以前的光镜观察表明，补阳还五汤对于脊髓损伤诱发的星形胶质细胞反应性增生具有一定抑制作用[1]。为了进一步研究补阳还五汤对星形胶质细胞反应性增生的调制作用，我们用星形细胞培养-划痕实验进行了观察。
1 材料与方法
1.1 脊髓星形胶质细胞培养
选择当日出生的Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供，合格证号：00519925)，无菌条件下取脊髓，剔除软脊膜及血管后，剪成1 mm3的小块，放置在培养液内。用0.25%胰蛋白酶37 ℃消化1 h；用DMEM培养液(含20%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，0.6%葡萄糖)终止胰蛋白酶的消化作用；用吸管吹打，使消化后的脊髓组织分散成单个细胞的悬液。把细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的35 mm2培养皿中，种植密度为1×105个/cm2；于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；24 h后换成10%胎牛血清的DMEM培养液培养，每3 d换液1次；培养至第12日，加入10 mmol/L 左旋酪氨酸甲基脂于37 ℃放置1 h，除杀小胶质细胞；立即更换新培养液，在CO2培养箱中维持培养至第15日，星形胶质细胞长满培养皿底。
1.2 划痕损伤实验
1.2.1 分组
于第15日时，将细胞培养皿随机分为补阳还五汤组和不加中药的空白对照组(每组7个培养皿，即分为7个时间点)。
1.2.2 划痕
用塑料吸头划刮培养皿，造成宽约1 mm、长约1.5 cm的损伤带。
1.2.3 再培养
划痕后立即编号和更换培养液。补阳还五汤组的培养液中按5 ηL/mL比例加入补阳还五汤，空白对照组只更换培养液。放入37 ℃、CO2培养箱中继续培养。
1.2.4 显微镜观察和记录
在划痕后0、2、6、12、24、48、72 h等7个时间点分别取出培养皿，对划痕区星形细胞生长情况进行显微镜观察、拍照和记录。
1.3 胶质原纤维酸性蛋白表达实验
1.3.1 固定
样本用PBS(pH 7.3)冲洗后，立即用4%多聚甲醛在室温下固定1 h。再用PBS清洗3次后，放入4 ℃冰箱内保存。
1.3.2 胶质原纤维酸性蛋白表达反应
至所有时间点样本收齐后，按ABC法进行GFAP表达的免疫细胞化学反应。
1.3.3 胶质原纤维酸性蛋白表达产物光密度的图像分析
从每一个时间点的样本中随机选择划痕边缘的5个视野，用CIMAS软件对视野内的神经胶质细胞面积和细胞质内GFAP阳性反应物的积分光密度进行测定，对数据进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 体外培养机械损伤实验星形胶质细胞增生情况的观察
划伤后的初期(0 h)：在划伤区的边缘未见增生的胶质细胞。空白对照组同补阳还五汤组没有明显差别。划伤后2 h：在空白对照组划伤区的边缘可见增生的细胞团，但是没有向划痕区迁移的细胞；在补阳还五汤组划伤区的边缘未见增生或迁移的细胞。划伤后6 h：空白对照组星形胶质细胞开始从划伤区边缘向划痕区迁移，细胞呈串珠状排列；补阳还五汤组划痕区边缘可见增生的细胞，但未见迁移的细胞。划伤后12 h：空白对照组有大量的星形胶质细胞从划伤区边缘迁入划痕区，使划痕空白区面积缩小；补阳还五汤组划痕区边缘有少量单个星形胶质细胞迁入划痕区，划痕空白区宽阔。划伤后24 h：空白对照组在划痕区内有大量增生的星形胶质细胞连接成片，在损伤区中央仅留有较窄的无细胞的空白区；补阳还五汤组的划痕区内虽有较多的胶质细胞，但是在损伤区中部还有较宽的空白区域。划伤后48 h：空白对照组增殖的胶质细胞已基本连接成片，划痕损伤区已没有明显可辨的空白区域；补阳还五汤组胶质细胞生长较慢，划痕区仍有一条明显可辨的空白区域。划伤后72 h：空白对照组增生的胶质细胞已经完全将整个损伤区充满，已经分辨不出损伤区和未损伤区；补阳还五汤组的损伤区有比较多的细胞，与空白对照组区别不大。
2.2 划痕后星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白表达情况
从统计学分析可以看出，在划痕后0 h和72 h，补阳还五汤组和空白对照组样本内GFAP表达产物的光密度没有统计学意义；在划痕2～48 h，2组的GFAP阳性表达产物光密度值差异有统计学意义，划痕后24 h是组间差异的巅峰期。见表1。表1 2组星形胶质细胞不同时间点GFAP阳性表达产物光密度值比较(略)注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.001
3 讨论
补阳还五汤出自清代医家王清任的《医林改错》，其药物组成为：黄芪、川芎、桃仁、赤芍、地龙、红花、当归等，主要运用于中风之气滞血瘀证。对中枢神经系统损伤修复作用明显，能显著改善脑缺血大鼠长期感觉运动功能，减轻脑损伤[2-4]。用一般组织学染色只能表明药物对胶质细胞数量多少的影响，而不能表明药物对增生星形细胞胶质化程度的调制。
为了探索补阳还五汤对反应性星形细胞胶质化程度的影响，我们利用了胶质细胞体外机械损伤模型。这种小面积划伤不仅可以诱发划痕边缘区星形细胞的增生，促进增生的星形细胞跨越划痕带形成“胶质瘢痕”；而且可以激发星形细胞的胶质化，使GFAP表达上调。因此，这个模型在一定程度上模拟了在体脊髓损伤诱发的星形细胞反应性增生、胶质化和瘢痕形成等过程。把补阳还五汤导入“体外胶质细胞培养和划痕实验”中，不仅可以验证药物抑制星形细胞反应性增生的效应；而且通过GFAP表达反应，可以了解药物对增生的星形细胞胶质化程度的调制作用。因为GFAP是星形胶质细胞特有的骨架蛋白，也是星形细胞胶质化的重要标志之一。在本实验中，空白对照组的星形细胞在划痕损伤后，经历了十分典型的星形细胞胶质化的过程，即刺激-增生、生长、迁移、连接-GFAP表达上调-细胞萎缩-GFAP表达下调”的事件和空间模式。这个模式也在一定程度上反映了脊髓损伤后胶质瘢痕形成的过程。
补阳还五汤不仅可以抑制星形细胞反应性增生，而且可以遏制增生细胞的胶质化过程。补阳还五汤具有抑制脊髓损伤诱发的星形细胞反应性增生的效应，而且可以遏制由于星形胶质细胞增生形成的瘢痕。这有利于损伤脊髓的修复再生。因为胶质瘢痕可以阻碍神经元突起的延伸，妨碍神经轴索的再生，阻止少突胶质细胞产生髓鞘和包绕轴索，胶质瘢痕确实是一道抑制性屏障(an inhibitory barrier)，它妨碍神经系统的正常功能及神经纤维的再生。也有一些关于抑制胶质增生有利于脊髓再生修复的报道。例如Wakefield等[5]报道，大鼠脊髓半横断损伤后，投给7 beta-hydroxycholesteryl-3-oleate，可以降低星形细胞增殖反应，使GFAP表达下调，并且促进中缝脊髓束色胺能神经纤维的再生。我们的研究结果与该报道有异曲同工之处。
参考文献
1] 赵永青，何 爽.中药髓复康对大鼠脊髓GFAP表达的影响[J].神经解剖学杂志，2006，22(2)：229－232.
[2] 储利胜，邵 亮.补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血损伤的长期保护作用[J].中国临床康复，2006，10(11)：56－58.
[3] 谢建军，赖 真.补阳还五汤对脑缺血再灌注后星形胶质细胞及热休克蛋白的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2005，3(3)：225－226.
[4] 赵康峰，赵康虎.高热对星形胶质细胞GFAP表达的影响[J].职业与健康，2004，20(12)：10－12.
[5] Wakefield AE， Ho SY. The use of lipid-coated microbubles as a delivery agent of beta-hydroxycholesterol in a radiofrequency lesion in the rat brain[J]. Neurosurgery，1998，42(3)：592－598.