作者：王琳，连方，马凤梅，刘延荷，孙振高，张艳萍，滕怀香
【摘要】 目的 观察二至天癸颗粒含药血清对初老小鼠卵巢颗粒细胞体外分泌功能的影响。方法 采用血清药理学方法，以不同含药量的初老小鼠血清，与体外培养的颗粒细胞共同培养48 h，观察二至天癸颗粒含药血清对初老小鼠卵巢颗粒细胞雌激素(E2)、孕酮(P)分泌量(化学发光免疫测定法)以及抑制素B(INHB)分泌量(ELISA法)的影响。结果 二至天癸颗粒含药血清可明显增加颗粒细胞E2、P、INHB的分泌量。结论 二至天癸颗粒可通过调节颗粒细胞的分泌功能进而改善初老小鼠卵巢功能。
【关键词】 二至天癸颗粒；卵巢颗粒细胞；雌激素；孕酮；抑制素B；含药血清
Abstract：Objective To study the effect of serum contained Erzhi Tiangui Granule on the secretion function of ovarian granulosa cells from primary senile mice. Methods The serum with decoction from primary senile mice was added to cultured granulosa cells and incubated for 48 h. Then the concentration of estradiol (E2)， progesterone (P) and inhibin B (INHB) in cultured medium were measured by chemiluminescence immunoassay (CLIA) and Sandwich ELISA respectively. Results The serum contained Erzhi Tiangui Granule could increase the secretion of E2， P and INHB. Conclusion Erzhi Tiangui Granule can improve the ovarian function of primary senile mice by regulating the secretion function of granulosa cells.
Key words：Erzhi Tiangui Granule；ovarian granulosa cell；estradiol；progesterone；inhibin B；serum contained drug
二至天癸颗粒是根据连方主任医师多年的临床研究组方而成，具有补肾益天癸、养血调冲任的作用，临床实践证明能够提高卵细胞质量，进而提高受精率、卵裂率和妊娠率[1]，动物实验也证明此方可改善小鼠受精率、卵裂率，并可促进早期胚胎分化[2]。为进一步探讨二至天癸颗粒提高高龄妇女卵巢反应性的作用机制，本实验以雌性自然衰老小鼠为研究对象，采用血清药理学方法，从影响颗粒细胞体外分泌功能的角度初步探讨其疗效机制。
1 实验材料
1.1 仪器
ACCESS化学免疫发光检测系统(Beckman USA)；酶标仪(Multiskan MK3 Thermo Labsystems)。
1.2 动物
初老昆明种小鼠，12月龄，雌性，体重50～70 g，山东中医药大学实验动物中心提供。
1.3 药物
二至天癸颗粒，山东中医药大学附属医院制剂室提供(院
内批号[01]FZ032-03)。药物组成：女贞子、墨旱莲、枸杞子、菟丝子、当归、白芍、川芎、熟地黄、制香附、炙甘草等。
1.4 试剂
DMEM/F-12培养基(1∶1)(Hyclone)；青链霉素溶液(Hyclone)；胎牛血清(GIBCO)；L-多聚赖氨酸(SIGMA)；人绝经期促性腺激素(HMG，中国丽珠集团丽宝生物化学制药公司生产)；人绒毛膜促性腺激素(HCG，中国丽珠集团丽宝生物化学制药公司生产)；雌二醇(E2)及孕酮(P)化学发光免疫测定试剂盒(BeckmanAccess公司)；抑制素B(INHB)试剂盒(美国DSL公司)。
2 实验方法
2.1 含药血清及正常血清的制备及灭活
将初老小鼠25只随机分为5组，分别为初老空白组、二至天癸高、中、低剂量组(分别按成人剂量的18、12、6倍剂量给药)以及六味地黄汤对照组。中药各组每日灌服2次，连续3 d。第4日8:00 Am灌胃1 h后，无菌条件下股动脉取血，对照组小鼠等量生理盐水灌胃，同时取血。将各组血液于4 ℃下放置4 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤器抽滤除菌，同组混匀，经56 ℃、30 min灭活分装，-20 ℃保存备用，同时将取血后的小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖，观察各组小鼠双侧卵巢。
2.2 颗粒细胞收集
取12月龄小鼠腹腔注射HMG 18 U，48 h后同时腹腔注射HCG 20 U，14～16 h后脱颈处死，解剖取出输卵管，在体式镜下用TB针划破输卵管壶腹部，收集包括卵子的颗粒细胞团。加入1 g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，用孔径为0.074 mm筛网过滤，1 000 r/min离心5 min。弃上清，用PBS(-)清洗3次，加入DMEM-F12培养液(含20%胎牛血清、1%青链霉素)重悬。
2.3 颗粒细胞培养
将颗粒细胞悬液按1×106/孔随机种入事先用0.05%L-多聚赖氨酸涂布的24孔培养板内，放入充5% CO2和95%空气的37 ℃恒温孵箱中预培养24 h，倒置显微镜下观察颗粒细胞生长情况。细胞贴壁后换入含10%小鼠血清(各组分别加入正常血清及低、中、高剂量含药血清)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM/F-12培养液，继续培养24 h后收集培养液，-20 ℃冻存，待测E2、P、INHB。
2.4 培养液中雌激素、孕酮以及抑制素B的测定
E2、P采用化学发光免疫法测定，INHB采用双抗夹心酶联免疫吸附法(Sandwich ELISA)测定，批内批间变异系数均小于10%，符合质量控制标准要求。
2.5 统计学方法
采用SPSS11.0 for windows软件进行统计， 数据以x±sx±s表示。组间采用方差分析，以P＜0.05为具有统计学意义。
3 结果
(见表1)表1 二至天癸颗粒含药血清对各组卵巢颗粒细胞分泌E2、P和INHB 的影响(略)注：与初老空白组比较，*P＜0.05；与六味地黄汤对照组比较，#P＜0.05
4 讨论
卵泡由一个居于核心的卵细胞及周围的颗粒细胞和卵泡膜细胞所组成。成熟卵泡的颗粒细胞是组成卵泡的最大细胞群，对卵母细胞起着重要的作用，并且是雌激素和孕激素的主要来源细胞。INHB亦为颗粒细胞分泌，其主要生理作用是反馈性抑制垂体卵泡刺激素分泌，由于不受促性腺激素释放激素、雌激素、雄激素等诸多因素影响，而能直接反映卵泡的发育情况。随着年龄的增长，由于卵泡数量减少及颗粒细胞的功能下降，血浆INHB水平明显下降。女性35岁之后，卵泡数量急剧减少，不能分泌足够的激素及生长因子，卵巢因卵泡数减少而出现功能衰退。在卵巢生殖功能衰退的同时，其内分泌功能也衰退，表现为其分泌的雌、孕激素和INHB减少。
二至天癸颗粒由菟丝子、女贞子、墨旱莲、枸杞子等组成，具有补肾益天癸、养血调冲任的作用，是治疗肾虚型不孕症的有效方剂，能在不减少卵细胞数目的前提下，有效提高卵细胞的质量[2]，并且能提高高龄不孕妇女的卵巢反应性[3]。以往实验证实，二至天癸颗粒在不影响非排卵数目的基础上可以提高卵细胞质量与鼠胚的卵裂能力；通过原位杂交检测小鼠卵巢IGF-1RmRNA表达量，二至天癸颗粒对其有增强作用，优质卵率与小鼠卵巢IGF-1RmRNA表达量呈正相关；由此推测，二至天癸颗粒提高卵细胞质量可能与增强小鼠卵巢IGF-1RmRNA表达量，提高IGF-1RmRNA的基因转录，引起颗粒细胞和卵细胞内的一系列酶促反应，达到促进卵细胞生长的效果有关[4]。本实验观察到，二至天癸颗粒高、中剂量组作用最明显，证明其作用有一定的剂量依赖性；其含药血清各剂量组与六味地黄汤组均能有效提高初老小鼠颗粒细胞雌、孕激素以及INHB的分泌量，且高剂量组疗效优于六味地黄汤组。提示二至天癸颗粒提高高龄不孕妇女卵巢反应性的机理可能与其促进颗粒细胞分泌E2、P、INHB有关。
【参考文献
】
[1] 连 方，张建伟，张 宁，等.中西医结合疗法在试管婴儿技术中的应用[J].山东中医药大学学报，2002，26(3)：182－183.
[2] 连 方，孙振高，张建伟，等.二至天癸方对小鼠卵细胞质量影响的实验研究[J].中国西医结合">中西医结合杂志，2004，24(7)：625－627.
[3] 连 方，王 琳，张建伟，等.二至天癸方对高龄不孕妇女卵巢反应性的影响[J].中国中西医结合杂志，2006，26(8)：686－688.
[4] 连 方，孙振高，穆 琳，等.二至天癸颗粒提高卵细胞质量与小鼠卵巢内IGF-1RmRNA表达量关系的研究[J].中国中西医结合杂志，2006，26(5)：431－434.