作者：邓元江，梁伟雄，刘卫英，程淑意
【摘要】 目的 观察生脉胶囊对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法 将75只雌性SD大鼠随机分为假手术组、心衰模型组、生脉胶囊组、卡托普利组、生脉胶囊＋卡托普利组，采用腹主动脉缩窄法造成大鼠慢性心力衰竭模型，分组治疗7周时测定大鼠心肌细胞凋亡率与抑制凋亡蛋白Bcl-2含量。结果 模型组心肌细胞凋亡率高于假手术组(P＜0.01)，生脉胶囊组、卡托普利组、生脉胶囊＋卡托普利组的细胞凋亡率均低于模型组(P＜0.01)。模型组心肌Bcl-2含量低于假手术组(P＜0.05)，生脉胶囊组、卡托普利组Bcl-2含量均高于模型组(P＜0.05或P＜0.01)。结论 生脉胶囊可提高心肌细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2含量，抑制心肌细胞凋亡，能减轻慢性心力衰竭大鼠的心室重构。
【关键词】 心力衰竭；生脉胶囊；细胞凋亡；Bcl-2；心室重构；大鼠
Abstract：Objective To research the effect of Shengmai capsules on cadiocyte apoptosis with chronic congestive heart failure (CHF) in rats. Methods Seventy five SD female rats were randomly pided into 5 groups：sham-operation group (A)， CHF model group (B)， CHF model treated by Shengmai capsules group (C)， CHF model treated by Captopril group (D)， CHF model treated by Shengmai capsule and Captopril group (E). Suprarenal abdominal artery constriction was operated to prepare CHF rat models. After 7 weeks treating respectively， the apoptosis rate of cadiocyte and the content of myocardia Bcl-2 in rats were detected. Results Apoptotic cells ratio of myocardia was higher in group B than in group A (P&<0.01)， and lower in group C， D， E than in group B (P&<0.01). The content of myocardia Bcl-2 was lower in group B than in group A (P&<0.05)， while that was higher in group C and D than in group B (P&<0.05 or P&<0.01). Conclusion Shengmai capsules can heighten the concentration of anti-apoptosis protein Bcl-2， prevent apoptosis in myocardium and relieve the ventricular remodeling of CHF rat.
Key words：congestive heart failure；Shengmai capsules；apoptosis；Bcl-2；ventricular remodeling；rat
心室重构是心力衰竭发生发展的根本原因[1]，而细胞凋亡
在心力衰竭心室重构过程中占重要地位。生脉胶囊是治疗慢性心力衰竭的有效中药制剂，我们发现其能改善心功能并且具有一定的抗心室重构的作用[2]。其作用是否与抑制细胞凋亡有关？本实验采用腹主动脉缩窄法复制大鼠慢性心力衰竭模型，探讨生脉胶囊对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡率及抑制凋亡蛋白Bcl-2的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
BM-VⅡ型生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司)，石蜡切片机(SHANDON)，Leica DC100图像分析仪(德国)。
1.2 药物与试剂
生脉胶囊(杭州正大青春宝药业有限公司，0.3 g/粒，由人参、麦冬、五味子组成，批号0503003)，卡托普利片(汕头金石制药总厂，批号050901)，注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂，批号C05051212)。乌拉坦(上海曹杨第二中学化工厂，批号050403)，水合氯醛(上海青析化工科技有限公司，批号20050117)。大鼠细胞凋亡检测试剂盒(批号200607)、大鼠Bcl-2一抗(批号200606)、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均为武汉博士德公司产品。
1.3 动物与分组
雌性SD大鼠75只，体质量为190～210 g，SPF级，广州中医药大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK(粤)2003- 0001)。将大鼠随机分为假手术组、心衰模型组、生脉胶囊组、卡托普利组、生脉胶囊＋卡托普利组，每组15只。因大鼠在造模后部分死亡，补做18只，共用大鼠93只。实验在广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室完成。
1.4 造模
采用腹主动脉缩窄法复制慢性心力衰竭大鼠模型[3-4]。大鼠以100 g/L乌拉坦(10 mL/kg)麻醉后，从剑突至脐沿正中线作一皮肤切口，钝性分离肌肉，打开腹腔，于双侧肾动脉上方分离腹主动脉，并在其下穿一根4号医用丝线，将一个去掉针尖的直径约0.80 mm的8号注射针头紧贴腹主动脉平行放置，将针头与腹主动脉一起结扎紧后，轻轻抽出针头，使该处腹主动脉横切面积缩窄为原来的40%～50%左右，缝合腹壁。术后腹腔注射青霉素钠(1×104 U/只)，每日1次，共5 d，预防感染，常规饲养，造模时间为7周。假手术组在双侧肾动脉上方的腹主动脉下穿线后打一较大的松结，而不缩窄腹主动脉，其他同模型组。
1.5 给药
生脉胶囊组：将生脉胶囊用蒸馏水配成混悬液，按成人9粒/d的剂量根据贺氏[5]剂量-体表面积换算成大鼠剂量的2倍灌胃。假手术组和心衰模型组：均以等容积蒸馏水灌胃。卡托普利组：将卡托普利片用蒸馏水配成混悬液，按成人150 mg/d的剂量根据体表面积换算成大鼠的剂量的2倍灌胃。生脉胶囊＋卡托普利组：按大鼠体表面积换算的剂量的2倍以生脉胶囊和卡托普利片混悬液灌胃。各组均于造模后第50日开始给药，每日上午灌胃1次，连续7周。
1.6 心肌标本的采集与石蜡切片的制作
治疗后7周，以10%水合氯醛麻醉大鼠后，摘取心脏，以冰冷的生理盐水冲洗去血液，小心剪去连接心脏的血管，沿房室交界处剪去心房、沿两心室间交界处剪去右心室，余下的为左心室肌，取部分侧壁左心室肌，以10%甲醛中固定。每组随机取8个经甲醛固定的心肌组织标本，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(4 μm)、捞片、烤片后，制成石蜡切片。
1.7 心肌细胞凋亡的测定
采用TUNEL(原位末端标记)法检测心肌细胞凋亡，以未作苏木素复染的标本片为阴性对照，与试剂盒中提供的阳性对照片作对比。在显微镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。再用图像分析仪在400倍下计算每张切片的5个不同视野的凋亡细胞与正常细胞的数目，分别算出细胞凋亡率，以其平均值表示。细胞凋亡率(%)＝凋亡细胞数目/(凋亡细胞数目＋正常细胞数目)×100%。
1.8 心肌Bcl-2含量的测定
采用免疫组化染色方法。一抗用1∶100的小鼠Bcl-2抗体。以0.02 mol/L的PBS代替一抗，作阴性对照片。显微镜下观察，再用图像分析系统进行半定量测定，在400倍下计算每张切片的5个不同视野的平均灰度(红光)，以平均值表示该标本的平均灰度。平均灰度与物质的含量成反变关系。
1.9 统计学方法
采用统计分析软件SPSS11.5 for Windows进行统计处理，多组均数比较用方差分析法。经方差分析，组间总体差异有统计学意义且满足正态性和方差齐性时，两两比较用LSD法；方差不齐时，选用Dunnett’s T3法。
2 结果
(见表1)表1 各组大鼠心肌细胞凋亡率与Bcl-2含量变化比较(略)注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与心衰模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
3 讨论
细胞凋亡是在基因调控下的细胞主动死亡过程，因此又称为程序化细胞死亡。凋亡是生命过程中细胞死亡的生理和病理机制的基础。
心力衰竭心室重构过程中存在心肌细胞数量的减少，主要通过坏死、凋亡两种方式来实现，坏死和凋亡引起心肌死亡是心室重构的重要原因。许多研究结果显示，心肌细胞的丢失是心室功能不全或心力衰竭发生发展的重要因素之一[6]。Teiger等[7]发现，压力负荷过重诱导鼠心肌细胞肥大和非心肌细胞增生的同时，还可导致心肌细胞的丢失，并证实有心肌细胞凋亡的增多，认为心肌细胞凋亡可能与心室重塑有关。除动物模型观察到心力衰竭时的细胞凋亡现象外，心力衰竭患者的心肌组织也得以证实。Ino等[8]对一名进行性左室壁变薄、收缩功能不全而死于心力衰竭的肥厚型心肌病患者尸检发现，变薄的室壁存在纤维化，利用免疫组织化学检测到凋亡细胞和凋亡小体，认为心肌细胞凋亡是导致肥厚型心肌病患者终末阶段室壁变薄、纤维化、收缩功能不全的因素。有些研究已经表明，终末期心衰患者心肌细胞的凋亡增加，扩张型心肌病中心肌细胞凋亡是终末期心衰的持续特征，且与疾病严重性有关。因此，细胞凋亡和左心室重构程度有密切关系。
本研究采用TUNEL法测定大鼠心肌细胞的凋亡率，发现持续压力后负荷增大所致的心力衰竭模型大鼠心室重构过程中存在细胞凋亡现象，心肌细胞凋亡率增加，高于假手术组(P＜0.01)，与季氏等[9]、张氏等[10]的结果相符。心肌功能的降低在某种程度上是由心肌细胞的丢失所致，其数量的逐渐减少是心肌重构的一个重要病理特征[11]。本研究结果也表明，生脉胶囊能降低心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡率，有保护心肌、减轻心室重构的作用，其作用与卡托普利相同。
细胞凋亡受到程序控制，参与细胞凋亡调控的相关基因分为两类[12]：一类是可抑制凋亡发生的抑制基因，如Bcl-2、Bcl-w、Bcl-XL、BFL-1等；另一类呈现促凋亡作用的基因，有Bax、Bak、Bok、Bcl-Xs、Hrk等。这两类基因相互作用的结果决定了细胞的生存或死亡，其中Bcl-2和Bax最受人们的重视。Bcl-2是第一个被发现参与凋亡调控的基因家族，Bcl-2和Bax是Bc1-2家族中的重要成员。许多研究表明，Bcl-2是抑制细胞凋亡过程中重要的调节因子，Bax是Bcl-2的同源基因，其结构与Bcl-2有21%的相似性，但功能与Bcl-2基因相反，具有促进细胞凋亡的作用。Bax蛋白可与Bcl-2蛋白形成异源二聚体，阻止Bcl-2的激活，具有促进凋亡的作用[13]。细胞Bcl-2/Bax的比率决定在凋亡信号刺激后细胞是存活还是死亡[14]。在压力负荷的诱导下，由心肌肥大向心力衰竭发展过程中，心肌细胞凋亡增加的同时伴随着Bcl-2、Bax蛋白表达的改变，对心肌细胞凋亡起了一定的作用，发生凋亡的机制与Bcl-2、Bax蛋白的表达改变有关[3]。
本实验结果提示，心力衰竭模型组大鼠左心室心肌Bcl-2的含量低于假手术组(P＜0.05)，表明心衰大鼠心肌抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达下降，细胞凋亡加快，凋亡细胞数目增加，与本实验心衰模型组的心肌细胞凋亡率高于假手术组相一致；细胞凋亡增多，促进了心室重构。生脉胶囊可上调压力超负荷致心衰大鼠心肌抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达，有抑制细胞凋亡的作用，从而可阻抑心室重构。耿氏等[15]采用结扎冠状动脉复制慢性心功能不全大鼠模型，造模后10周Bcl-2蛋白的表达低于假手术组；卡维地洛干预后可以使心肌细胞凋亡率及Bax蛋白表达水平降低，使Bcl-2蛋白表达水平增加。
有学者认为，心肌肥大和凋亡分别代表心脏代偿和衰竭的两种不同表现[16]。压力负荷、容量负荷导致的机械压力，急、慢性心肌缺血，儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ、醛固酮、心钠素、内皮素等神经内分泌激素，肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白介素-6、表皮生长因子、转化生长因子-β等细胞因子及氧自由基、细胞内钙离子超负荷等诱发因素可通过不同机制而激发胞内凋亡通路而产生心肌细胞凋亡[17-18]。这与本研究结果相一致。故生脉胶囊能提高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平，抑制慢性心力衰竭心肌细胞的凋亡，可能与其抗慢性心力衰竭心室重构有关。
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