【摘要】 目的 优选昆布中褐藻酸的最佳提取工艺。方法 采用正交设计L9(34)，考察溶剂量、提取时间、提取温度对褐藻酸含量和得率的影响，并进行方法学考察。结果 最佳制备工艺为A1B1C2，即药材加入30倍量1%Na2CO3溶液，60 ℃搅拌提取1 h。结论 提取温度为最重要的影响因素，高于60 ℃时褐藻酸含量会明显下降。优选出的最佳提取工艺是合理的。
【关键词】 昆布；褐藻酸；多糖；正交设计
Optimization of Alginic Acid in Laminaria japonica Aresch by Orthogonal Test LIU Xue-xiang， CHEN Jian-wei Nanjing University of TCM， Nanjing 210029， China Abstract：Objective To optimize the extraction technology of alginic acid in Laminaria japonica Aresch. Methods The influence of the amount of solvent， the extraction time and temperature (3 factors) on the alginic acid content and yield was investigated by orthogonal test L9(34)， and carried on to inspect the methodology. Result The optimum extraction condition was A1B1C2， that was adding 30 times solvent (1%Na2CO3)， whisk extracting for one hour at 60 ℃. Conclusion The temperature is the most important factor. The content of alginic acid decrease obviously at above 60 ℃. The optimum extraction technology is reasonable.
Key words：Laminaria japonica Aresch；alginic acid；polysaccharide；orthogonal design
昆布为海带科(Laminariaceae)植物海带Laminaria japonica Aresch.[L.ochotensis Miyabe]的干燥叶状体，含有多糖化合物，其中之一为褐藻酸盐(alginate)，系褐藻酸(alginic acid)及其钠、钾、铵、钙盐等，褐藻酸含量为24.3%，最高可达32%。本试验利用间萘二酚与糖醛酸反应呈色，于波长580 nm处有最大吸收的原理，测定构成褐藻酸的糖醛酸的含量，优选昆布中褐藻酸的最佳提取工艺。
1 仪器与试药
752型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)；电动搅拌器(江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂产品)；UV-2401型紫外分光光度计(日本岛津产品)。昆布购自南京白云亭农贸市场，经本校药学院陈建伟教授鉴定为海带科(Laminariaceae)植物海带Laminaria japonica Aresch.的干燥叶状体；对照品褐藻酸(自制)；间萘二酚(美国Sigma公司，含量99%以上，78H1166)。正戊醇、乙醚、浓硫酸均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计
根据不同制备工艺对昆布中褐藻酸含量的影响，选择溶剂量、提取时间、提取温度作为考察因素，应用L9(34)正交设计表进行试验。因素水平见表1。表1 因素水平表（略）
2.2 褐藻酸得率测定
精密称取干燥剪细的样品2 g，加入1%Na2CO3溶液，按L9(34)正交试验表所列进行搅拌提取。离心，取上清液，加稀盐酸(3→10)搅拌至pH 2.0，析出凝胶，依次用75%、85%、95%乙醇洗涤脱水，得棕色粉末，50 ℃干燥至恒重，取出，置干燥器内冷却至室温，精密称定重量，计算得率[1]。
2.3 褐藻酸含量测定[2]
2.3.1 线性关系考察
精密称取褐藻酸对照品25.1 mg，加入1.25 mL 80%冷至0 ℃的硫酸溶液，放置1 h，待其溶解后，置50 mL量瓶中，加冰水至刻度，摇匀，即得浓度为0.502 mg/mL的褐藻酸标准贮备液。分别精密吸取标准贮备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得到浓度分别为5.02、10.04、20.08、30.12、40.16 μg/mL的标准溶液。再分别精密吸取标准溶液2 mL于25 mL具塞比色管中，加入2 mL间萘二酚溶液及2 mL盐酸，振摇混合，将此液在沸水中加热45 min，再在冰水中冷却10 min，向此液中准确加入10 mL乙醚-正戊醇(5∶1)混合液，加盖，激烈振摇混合，分取乙醚-正戊醇层，置752型紫外可见分光光度计于580 nm处测定吸收度。以浓度(μg)为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：A＝0.006 882X＋0.016 77，r＝0.999 4。结果表明，在10.04～80.32 μg范围内线性关系良好。
2.3.2 稳定性试验
取某一浓度的标准溶液(20.08 μg/mL)，精密吸取2 mL，按标准曲线制备法每隔10 min测定1次A值，RSD＝0.27%(n＝7)，表明在1 h内溶液是稳定的。
2.3.3 加样回收率试验
取已知含量的1#样品，共5份，每份0.1 g，精密称定，分别加入褐藻酸对照品5 mg，按样品的含量测定方法进行测定，结果平均回收率为96.74%，RSD＝0.85%(n＝5)。
2.3.4 样品含量测定
精密称取样品粉末10 mg，加入2.5 mL 80%冷至0 ℃的硫酸溶液，用玻棒磨碎，放置1 h，待溶解后，加冰水定容于100 mL量瓶中，再精密吸取1 mL，加冰水定容于5 mL量瓶中，吸取2 mL，按“2.3.1”项下方法进行测定，并用外标两点法计算褐藻酸的含量。
2.4 正交试验结果
(见表2)表2 昆布中褐藻酸提取工艺正交试验结果（略）注：Y=Y1/Y1×40%+Y2/Y2×60%
2.5 方差分析
(见表3)表3 方差分析（略）注：F1－0.05(2，2)=19，F1－0.01(2，2)=99
2.6 验证试验
分别称取3份样品，各2 g，按最佳工艺制备方法制备，测定，平均含量为78.68%，RSD＝1.19%(n＝3)，表明该工艺稳定可行。
3 讨论
从表3可以看出，方差分析差异无统计学意义。直观分析，从R值看，C因素(即提取温度)为最重要的影响因素；整体看，60 ℃提取样品中褐藻酸的百分含量明显高于其余两水平，且得率较低，而70 ℃提取得率较高，又并未提高样品中褐藻酸的百分含量，说明在70 ℃提取样品杂质含量提高，对提取不利，分析原因可能是褐藻酸在70 ℃以上的高温条件下会有所降解。同时又选择80 ℃制备了3份样品，结果表明，褐藻酸的含量明显下降(含量分别为55.3%、56.8%、56.2%，平均含量为56.1%)，故建议在提取酸性多糖褐藻酸时应进行低温提取，避免高温下有效成分的损失。B因素为最次要因素，本着节能的原则，故选择提取1 h。A因素，考虑到节省溶剂，选择30倍量。表2中的综合分是根据样品得率和褐藻酸含量的权重计算得来。
由于药材在溶剂中易膨胀，呈粘稠状，故选择溶剂量比通常的溶剂量要大，这样才能更有效地将有效成分提取出来，且有利于提取液的离心。
褐藻酸的含量测定方法有重量法和容量法[1]，但操作步骤较复杂。通常糖醛酸的定量可采用咔唑-硫酸反应法[1]，但该法对褐藻酸的灵敏度低。曾采用苯酚-硫酸法测定其含量，但该法对所有多糖均有显色反应，即专属性差，不能有效地针对昆布中多糖成分之一褐藻酸进行定量测定。
参考文献
[1] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社，1987. 247，293.
[2] 马家骧，高鹤娟，戴 滢，等.食品中添加剂的分析方法[M].北京：中国标准出版社，1988.568－574.