作者：王绮雯，吴启端，陈奕芝
【摘要】 目的 观察β-细辛醚对缺血/再灌注损伤(MI/RI)心肌细胞的保护作用。方法 体外培养原代乳鼠心肌细胞，采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)诱导心肌细胞MI/RI，测定细胞存活率(MTT法)和细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量。结果 在MI/RI模型中，β-细辛醚能显著提高细胞存活率，明显降低培养液中LDH、CK的含量。结论 β-细辛醚对MI/RI心肌细胞具有显著的保护作用。
【关键词】 β-细辛醚；心肌细胞；缺血/再灌注；连二亚硫酸钠
Key words：β-asarone；cardiac myocytes；ischemia/reperfusion；Na2S2O4
石菖蒲为天南星科植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.)的根茎，为芳香开窍药。石菖蒲根茎和叶均含挥发油(0.11%～0.42%)，挥发油中已经发现34种成分，其主要成分为β-细辛醚(63.2%～81.2%)。β-细辛醚具有改善血小板的粘附聚集性[1]、扩张冠状动脉[2]、降血脂[3]等多种保护心血管系统的作用。本研究采用原代培养乳鼠心肌细胞观察β-细辛醚对缺血/再灌注损伤(MI/RI)心肌细胞的保护作用。
1 实验材料
1.1 药物和试剂
β-细辛醚(纯度为99.44%，本院实验中心提供。临用前用吐温-80、甘油助溶，比例为β-细辛醚∶吐温-80∶甘油＝1∶1∶1)；连二亚硫酸钠(Na2S2O4，天津市福晨化学试剂厂)；0.25%胰酶、高糖DMEM粉剂培养基(GIBCO)；新生牛血清(TBD)；5’-溴-2’-脱氧尿苷、二甲基亚砜(Sigma)；四唑盐(MTT，广州威佳科技有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2 动物
出生24 h以内的SD乳大鼠，广州中医药大学实验动物中心提供。
1.3 主要仪器
CO2培养箱(NAPCO)；LX50/LX70倒置显微镜(OLYMPUS)；BIO-RAD550型酶标仪(日本生产)；6010紫外/可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)。
2 实验方法
2.1 乳鼠心肌细胞的分离培养
取出生24 h以内的SD乳大鼠，用75%酒精消毒后，剪开胸腔，钝性分离心脏，预冷PBS缓冲液，反复清洗3次，剪成3 mm3大小的块状，放入小瓶子中，加入0.25%胰蛋白酶，4 ℃放置16 h。然后小心去除胰酶，重新加入0.25%胰酶，37 ℃放置20 min，加入含10%新生牛血清的DMEM培养基终止消化后，用吸管轻轻吹打混合物至组织完全散开。100目钢筛过滤细胞悬液，滤液收集于10 mL刻度离心管中。然后按差速贴壁分离法将细胞置于培养箱孵育2 h，纯化心肌细胞。未贴壁细胞计数后，加入终浓度为0.1 mmol/L的5’-溴-2’-脱氧尿苷，抑制非心肌细胞成长，按1×106/mL的细胞浓度接种于24孔板，每孔1 mL；96孔板，每孔100 μL。置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。培养前3 d加入5’-溴-2’-脱氧尿苷抑制成纤维细胞分裂增生，每24 h更换1次培养液，培养3～5 d待实验。
2.2 造模、分组及给药
采用化学缺氧法，使用氧清除剂Na2S2O4建立缺氧模型[4]。配制终浓度为1 mmol/L Na2S2O4的PBS液为缺氧溶液(临用时配制，避光)。将正常的细胞培养液换成缺氧液，CO2培养箱中孵育2 h，造成细胞缺氧。再将缺氧液换成正常培养液孵育18 h，造成复氧再灌注损伤，之后立即收集细胞进行相关实验。实验分为6组，正常对照组：心肌细胞不做任何处理，按正常条件培养；模型组：将细胞按照上述模型复制方法处理；β-细辛醚高、中、低剂量组：心肌细胞再灌注同时加入25、12.5、6.25 μg/mL β-细辛醚的DMEM培养液作用18 h；基质组：心肌细胞再灌注同时加入与给药组等量基质的DMEM培养液作用18 h。
2.3 MTT法检测缺血/再灌注心肌细胞存活率
心肌细胞悬液接种到96 孔板，每孔100 μL，待细胞贴壁后，按以上分组及方法处理。MI/RI造模后每孔加入10 μL MTT (5 g/L)，置37 ℃、5%C02饱和湿度的C02培养箱作用4 h，小心吸细胞上清液，加入150 μL二甲基亚砜裂解，置微量振荡器振荡10 min，待孔内颗粒完全溶解后，在酶联免疫仪上于570 nm波长处测定各孔吸光度(OD)值。
2.4 培养液中乳酸脱氢酶、肌酸激酶的含量测定
心肌细胞悬液接种到24孔板，每孔1 mL，待细胞贴壁后，按以上分组及方法处理后，取其培养液，根据试剂盒步骤，测定LDH、CK的含量。
2.5 统计学方法
所有数据以x±sx±s表示，采用SPSS 11.0软件分析，组间比较采用方差分析。
转贴于3 结果
3.1 β-细辛醚对缺血/再灌注心肌细胞的存活率、乳酸脱氢酶、肌酸激酶的影响
(见表1)表1 β-细辛醚对MI/RI心肌细胞存活率及培养液中LDH、CK的影响(略)注：与模型组比较，*P≤0.05；与基质组比较，△P≤0.05
3.2 心肌细胞生长状态的观察
在分离心肌时，由于生物酶及机械作用的破坏，使刚分离
的细胞存在有不同程度的皱缩，心肌细胞在贴壁之前呈圆形，培养4 h细胞开始贴壁生长，呈圆形，后伸出伪足变成菱形、多角形、宽梭形等形状。12 h细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动的频率、节律不同。第3日细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，收缩明显而有力，形成所谓功能性合体细胞，搏动频率多在40～110次/min。同一培养瓶中，细胞簇间的搏动频率可不同。
4 讨论
乳鼠心肌细胞经胰酶消化下来的细胞除了心肌细胞，还有很多非心肌细胞(主要是成纤维细胞和内皮细胞)。由于非心肌细胞的增殖速度快，即使少量存在也会很快超过心肌细胞的数量，占据心肌细胞之间的空间，限制心肌细胞的活动，甚至分泌生物活性物质影响心肌细胞的形态结构和生理功能。因此，如果不能纯化培养，一方面不能模拟体内生长状态，另一方面也使培养缺乏重复性和稳定性，影响实验结果。因此，原代培养的关键是尽量去除非心肌细胞，保证心肌细胞的纯度。本实验采用差速贴壁的方法，同时在心肌细胞培养前3 d加入含终浓度为0.1 mmol/L的Brdu [5-8]的10%新生牛血清的培养基培养。Brdu能引起非心肌细胞染色体的异染色质部分发生断裂，使细胞处于G0期而不增殖，从而保证较长时间培养条件下心肌细胞仍占大多数。研究证明，在培养液中短期加入低浓度的Brdu，对心肌细胞的显微结构和特性无影响。
在细胞水平上，常以乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模拟在体MI/RI。心肌细胞缺氧/复氧后引起损伤的机制与氧自由基的释放、钙超载、细胞死亡和凋亡等有关[9]。心肌是体内摄氧量最高的组织，这一特点决定了心肌细胞对各种能引起心肌缺血缺氧的因素特别敏感，而短时间急剧缺血缺氧比长时间持续轻度缺氧更易造成心肌损伤。Na2S2O4是一种氧清除剂，它能迅速清除融入培养基质中的氧，并不会损伤细胞膜，一般在给予适当剂量2～10 min即可清除培养基中的氧，造成心肌细胞缺氧；缺氧后换液，洗去Na2S2O4后即造成复氧[10-12]。利用这一特性，经过多次摸索，选用1 mmol/L Na2S2O4的PBS液造成心肌细胞“缺血性”损伤后，换正常培养液即成再灌注损伤。相关指标表明本研究模型完全符合MI/RI特点。
MTT实验结果可以反映活细胞及琥珀酸呼吸链的状态，结果表明，β-细辛醚中、低剂量组细胞活性与模型组比较显著增加，说明β-细辛醚对Na2S2O4造成的心肌细胞损伤有一定的保护作用。
心脏是血液循环的动力器官，几乎完全依赖有氧代谢提供能量，因此，心肌细胞对缺氧极为敏感[13]。心肌细胞的缺血性损伤是一个动态发展的过程，若缺血状态持续或恶化，心肌细胞的缺血性损伤继续发展，细胞内Ca2+超载和氧自由基引发的膜损伤不断加剧，膜破坏至心肌酶漏出，最终导致细胞的不可逆损伤，发生细胞坏死，因此，心肌酶含量的变化是反映心肌坏死的重要指标[14]，也是细胞膜完整性的生化标准[15]。测定细胞培养上清液中心肌酶(LDH、CK)的水平能反映细胞损伤的程度。研究表明，与模型组比较，不同剂量的β-细辛醚明显降低LDH、CK的外漏，减轻了MI/RI后细胞膜的损伤程度，有效维持着心肌细胞膜的结构和功能。由此可见，β-细辛醚对Na2S2O4造成的MI/RI心肌细胞具有显著的保护作用，但其作用机制有待进一步深入研究。
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