作者：熊丽丽，陈泽奇，黄娟，傅擎宇
【摘要】 目的 观察加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响，探讨其对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。方法 用1%链脲佐菌素诱发糖尿病模型，72 h后尾静脉采血测定血糖，凡血糖＞16.7 mmol/L者纳入实验。造模稳定1周后，加味补肝汤组予加味补肝汤灌胃[28.6 g/(kg·d)]，分别于用药后第4、8周2个时间点处死大鼠，用免疫组织化学法检测坐骨神经中BDNF蛋白的表达，通过Motic Images Advanced彩色图文分析系统测定免疫反应产物BDNF蛋白的灰度值。结果 在4、8周模型对照组坐骨神经中BDNF阳性的表达比正常对照组明显减少(P＜0.05)，第8周时BDNF表达比4周时增多。经加味补肝汤治疗后BDNF的阳性表达比模型组表达明显增多(P＜0.05)。结论 加味补肝汤能上调糖尿病大鼠坐骨神经中BDNF的表达，对糖尿病大鼠周围神经病变有一定的防治作用。
【关键词】 加味补肝汤；糖尿病周围神经病变；坐骨神经；脑源性神经生长因子；大鼠
Key words：Jiawei Bugan decoction；diabetic peripheral neuropathy；sciatic nerve；brain-derived neurotrophic factor；rat
神经病变是糖尿病最常见的并发症，包括周围神经病变和中枢神经病变，尤以前者多见[1]。通过多年的临床观察，加味补肝汤对糖尿病周围神经病变(DPN)有明显的疗效。前期研究表明，加味补肝汤对链脲佐菌素(STZ)诱导的DPN大鼠有减轻病情的作用[2]。为了进一步探讨加味补肝汤对DPN的保护作用，本研究以STZ诱发实验性DPN模型，研究脑源性神经营养因子(BDNF)在糖尿病周围神经病变中的保护作用。
1 实验材料
1.1 动物
选用健康清洁级8周雄性Wistar大鼠60只，体质量220～270 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-003。
1.2 主要试剂和仪器
Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon)，德国罗氏公司ACCU-CHEC血糖仪，Motic Images Advanced彩色图文分析系统(MOTIC CHINA GROUP CO.LTD)，STZ(美国Sigma)，兔抗BDNF多克隆抗体、即用型SABC试剂盒(武汉博士德)，DAB显色试剂盒(北京中山生物技术公司)，其他试剂由中南大学湘雅医院药房提供。
1.3 药物
加味补肝汤由枸杞15 g、木瓜15 g、当归10 g、川芎10 g、熟地黄12 g、白芍15 g、桑寄生15 g、麦冬15 g、天花粉15 g等组成，以 28.6 g/(kg·d)灌胃(按体表面积计算70 kg体质量成人临床用量的等效量)。
2 实验方法
2.1 分组及造模
Wistar大鼠60只适应性喂养1周，按照SAS统计软件包产生的随机表，随机将大鼠分为正常对照组20只、模型组20只、加味补肝汤组20只。模型组和加味补肝汤组大鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射1%的STZ(50 mg/kg，pH 4.2～4.5，0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制)诱导糖尿病大鼠模型。造模后12 h内饮用糖水，随后饮用自来水，72 h后尾静脉采血测定血糖，凡血糖＞16.7 mmol/L者纳入实验。正常对照组20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相应容积的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，造模稳定1周后加味补肝汤组用中药加味补肝汤灌胃治疗。模型组和正常对照组则用等体积的蒸馏水灌胃治疗，实验期间自由饮水。用药后分别于4、8周测大鼠体质量和血糖。
2.2 标本提取
分别于用药后第4、8周一次性腹腔注射10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，剑突下横切口，沿膈肌与胸廓交界处剪开膈肌，剪断两根肋骨，暴露心脏，用针头与心尖左缘成45o～60o方向向上进针，插入升主动脉(同时剪开右心耳)固定针头，快速滴入37 ℃生理盐水100 mL，无血污后改为滴入固定液(4 ℃， 40 g/L多聚甲醛PBS 1 mL/min)250 mL。后俯卧位固定，取左侧梨状肌下缘坐骨神经约1 cm，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚约5 μm，每隔20张取2张贴于多聚赖氨酸处理的玻片上，烤干后4 ℃保存，留做免疫组化检测。
转贴于2.3 指标检测
免疫组织化学检测坐骨神经内BDNF的操作步骤如下：二甲苯常规脱蜡，100%、95%、80%、70%酒精梯度水化，蒸馏水充分浸洗；3%h3O2-甲醇灭活内源性过氧化物酶20 min， 0.01 mol/L PBS(下同)洗5 min/次×3次；EDTA水浴修复抗原，PBS洗5 min/次×3次；滴加5%BSA封闭液，置湿盒中37 ℃孵育30 min后，甩去多余液体，勿洗；滴加适当稀释的BDNF抗体(工作浓度为1∶200)，置湿盒中37 ℃孵育1 h，4 ℃过夜；复温至37 ℃，PBS洗5 min/次×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min/次×3次；滴加辣根酶标记链亲合素(SABC)，置湿盒中37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min/次×3次；DAB显色，显微镜下控制反应时间，有表达后蒸馏水洗5 min/次×3次以终止反应；70%、80%、95%、100%酒精依次梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。分别以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性，在Motic显微镜下照相，用计算机图像处理技术对免疫组化检测结果进行半定量分析，通过Motic Images Advanced彩色图文分析系统，测定免疫反应产物BDNF蛋白的灰度值，测定结果扣除背底及阴性值，免疫组化产物染色越深，灰度值就越小，抗原物质的含量就越高，表达强度越高。
2.4 统计学方法
数据采用SPSS 13.0软件包完成统计处理。计量结果以x±sx±s表示，多组均数的比较采用方差分析，计量资料组间差异比较采用q检验，检验的显著水平为P＜0.05。
3 结果
3.1 一般状态观察
连续给药8周后，正常对照组大鼠表现为精神状态好，体质量增加明显，活动自如。模型对照组在STZ注射72 h后逐渐出现多饮、多食、多尿、体质量减轻、毛竖无光泽、蜷卧拱背等糖尿病症状。加味补肝汤组也有类似表现，但程度较模型组轻。整个观察过程中，正常对照组无动物死亡，模型组大鼠饲养中有7只死亡，6只为感染所致，另1只死因不明确。加味补肝汤治疗组大鼠有6只死亡，均死于感染。死亡大鼠均重新购入大鼠，造模，补足各组大鼠数。结果见表1。 表1 各组大鼠体质量水平比较(略)注：与同期正常对照组比较，*P＜0.05
3.2 坐骨神经形态结构变化
光镜下观察坐骨神经病理变化：正常对照组大鼠坐骨神经有髓神经纤维形态和结构正常，有完整的结构形态。模型组出现明显的损伤反应，髓鞘空泡变性，结构异常，神经纤维变细，部分纤维出现断裂，朗飞节之间间隙变宽，部分神经组织局部发生明显肿胀，雪旺式细胞增殖，轴突萎缩甚至消失。加味补肝汤组与模型组比较，病变程度减轻。
3.3 免疫组化检测结果
BDNF的阳性细胞多分布在坐骨神经的中小神经元细胞，神经膜和轴突表达强阳性，髓鞘中也有表达。在第4、8周时模型组坐骨神经纤维中神经膜、轴突中BDNF的阳性表达比正常对照组大鼠减少，但第8周时BDNF表达比4周时增多，经图像分析处理，其平均灰度值与同期正常对照组比较，P＜0.05，与同组前一个时间点比较，P＜0.05。用加味补肝汤治疗后，在第4、8周中大鼠坐骨神经纤维中神经膜、轴突中BDNF的阳性表达随着治疗时间而增加，其灰度值P＜0.05。结果见表2。 表2 各组大鼠坐骨神经中BDNF阳性产物图像分析结果(略)注：与同期正常对照组比较，*P＜0.05；与同期模型组比较，#P＜0.05；与本组前一个时间点比较，△P＜0.05
4 讨论
目前认为DPN的机制十分复杂，国外的研究大多集中在糖尿病氧化应激上，认为氧化应激是DPN病变的最后通路。DPN后神经再生问题成了近年研究的热点，而神经营养因子家族成了热点中的焦点问题。缺乏神经营养因子被认为是糖尿病神经病变的主要原因[3]。神经营养因子是一类在靶组织内合成并逆行运输至效应神经元的，能对中枢和周围神经发挥营养作用的小分子肽类物质和蛋白质。BDNF是神经营养因子家族中最具代表性的成员之一，他们与神经生长因子(NGF)有50%同源性，广泛存在于中枢和周围神经系统中，对中枢和周围神经组织有广泛作用，对神经元发育有促进作用，并能使受损神经元免于凋亡。
国外有文献报道，用外源性的BDNF治疗糖尿病db/db小鼠，能明显减轻体质量和降低血糖[4]，这些研究结果表明BDNF的减少在DPN发病中起重要作用。本实验发现，高糖条件下，周围神经组织中BDNF蛋白的表达下降，减弱了受损神经纤维的修复能力，这可能是周围神经功能和结构受损的原因之一。模型组8周时比4周明显增多，可能是持续高糖环境下BDNF代偿性的增加来保护神经组织。用加味补肝汤治疗DPN大鼠后，BDNF蛋白在坐骨神经中的表达出现上调，并随着治疗的进行而增多。
DPN属中医学“消渴”合并“痹证”、“脉痹”等范畴。其病机是燥热亢盛、阴津亏损，调肝养肝、活血通络是治疗DPN的主要方法之一。补肝汤出自《医宗金鉴》，是滋养肝血的代表方剂，加味补肝汤是补肝汤加丹参、天花粉等组成。方中熟地黄甘温，归经肝肾，养血滋阴，为君药。当归辛苦甘温，归经入肝，补血活血，为臣药。佐以白芍，苦酸微寒，养血敛阴；木瓜、甘草酸甘化阴，舒筋活络；麦冬、酸枣仁滋养肝阴。使以川芎，辛温入肝，活血行气。配桑寄生、枸杞子补肾养肝，丹参活血通络，天花粉清热生津、润燥止渴等。全方共奏养肝活血通络之功，故能有效改善微循环，增加血流量，上调相应的神经营养因子营养神经组织，改善组织的缺血、缺氧，从而能有效地改善DPN的症状。本实验结果表明，加味补肝汤可明显上调内源性BDNF蛋白的表达，其机制可能与营养神经组织，从而改善神经组织的缺血、缺氧和组织损伤有关，进而对DPN具有防治作用。
参考文献
1] JD Curb， BL Rodriguez， RD Abbott， et al. Longitudinal association of vascular and Alzheimer’s dementias， diabetes， and glucose tolerance[J]. Neurology，1999，52：971－975.
[2] 叶仁群，陈泽奇，贺钰磊，等.加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经NGF表达的影响[J].北京中医药大学学报，2007，30(2)：90－94.
[3] A Nitta， R Murai， N Suzuki， et al. Diabetic neuropathies in brain are induced by deficiency of BDNF[J]. Neurotoxicology and Teratology， 2002，24：695－701.
[4] A Tsuchida， Nonomura， M Ono-Kishino. Acute effects of brain- derived neurotrophic factor on energy expenditure in obese diabetic mice[J]. Obesity，2001，25(9)：1286－1293.