作者：扈玉华，路建荣，朱习会，张明明，王军霞
【摘要】 目的 观察匙羹藤提取物(Gymnema sylvestre extractant，GE)的体外抑菌活性。方法 采用琼脂稀释的实验方法，分别测定匙羹藤提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌以及绿脓杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果 匙羹藤提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌以及绿脓杆菌的MIC分别为0.625、1.25、1.25、2.5 mg/mL。结论 匙羹藤提取物对多种细菌具有抑菌作用。
【关键词】 匙羹藤提取物；体外抑菌活性；最低抑菌浓度
Key words：Gymnema sylvestre extractant；in vitro antibacteral activity；minimum inhibitory concentration
匙羹藤(Gymnema sylvestre)系萝摩科植物，主要分布在我国广东、广西、福建、台湾和云南等省区。全株可药用，民间用于治疗风湿性关节痛、糖尿病、疥痈肿毒、毒蛇咬伤、枪弹伤及杀虱等[1]。近年来，匙羹藤引起了国内外学者的高度重视，对其化学成分和药理作用进行了大量的研究，但仅限于降血糖、抗龋齿和抑制甜味反应等作用。本研究主要对匙羹藤提取物的抑菌效果进行了实验观察，现将试验结果报道如下。
1 材料
1.1 仪器
微量多点接种仪：北京医科大学昆仑药物发展研究所生产。微量移液器：德国Eppendorf公司。
1.2 培养基
Mulele-Hrint琼脂：法国生物梅里埃公司生产，简称M-H琼脂。
1.3 药材
购广西产匙羹藤叶。取匙羹藤干燥叶1.0 kg，粉碎后，加40%乙醇水溶液加热提取3次[2]，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，母液于水浴上蒸干，得深棕色提取物122 g。然后加适量的水溶解，用水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇层并减压蒸干，用正己烷脱脂，脱脂产物用甲醇提取，浓缩甲醇分别用70%的乙醇水溶液4 L回流提取4次，合并提取液，浓缩至干，得匙羹
藤提取物25.1 g。
1.4 菌种及菌悬液的制备
标准菌株：金黄色葡萄球菌(25923)、大肠杆菌(25922)、绿脓杆菌(27853)、变形杆菌(29383)均由河北医科大学微生物实验室提供。分别取其标准菌株，采用16 h新鲜斜面培养物，用生理盐水稀释成含菌量为105～106 cfu/mL的菌悬液[3]。
2 方法
2.1 纸片琼脂扩散法抑菌试验[4]
2.1.1 菌片的制备[5]
将定性滤纸制成6 mm直径的圆片，经高压蒸汽灭菌后，干燥保存备用。取处理好的滤纸片放入无菌平皿中，用10 μL移液器把含匙羹藤提取物浓度为50%的提取液滴加在无菌滤纸片上，阴性对照片滴加10 μL的生理盐水，置无菌室晾干，阳性对照选用已制好的标准的药敏头孢塞肟纸片。
2.1.2 步骤
首先在M-H琼脂平板表面均匀的涂抹试验菌悬液，置室温干燥5 min，在每个平板表面周边距贴3个试验和1个阴性对照纸片，中心贴1个阳性对照纸片。然后将贴好纸片的平板放在37 ℃温箱中培养24 h，观察结果。用数显游标卡尺测量数据。
2.1.3 判定标准
抑菌环直径大于7 mm者判为有抑菌作用，抑菌环直径小于或等于7 mm为无抑菌作用，阴性对照应无抑菌环产生，否则试验无效，抑菌环越大说明抑菌效果越好。
2.2 最低抑菌浓度的测定
2.2.1 步骤
用蒸馏水将匙羹藤提取物配制成5%的提取液，排列无菌试管(6支编序)，在1－6支试管中分别加入10 mL的M-H液体培养基，于第1支试管中加入10 mL 5%匙羹藤提取液，混匀，然后取出的10 mL 5%匙羹藤提取液加入第2支试管中，混匀，依次类推，第5支试管中取出10 mL弃掉，而第6支试管不加药物作为阴性对照。最后在每个试管中加入0.1 mL试验菌悬液，混匀，阳性对照取西药抗生素头孢三代头孢米诺钠，用同样的方法依次稀释相对应的浓度。然后在37 ℃温箱中培养24 h，观察结果。
2.2.2 判定标准
含药物的试管中以及阳性对照的试管中液体清亮判断为该药物有抑菌作用，阴性对照的试管中液体浑浊判断为该药物无抑菌作用，倍比稀释后有抑菌作用的最低药物浓度判为该中药提取物的最低抑菌浓度(MIC)。
3 结果
(见表1、表2)表1 匙羹藤提取物对不同试验菌抑菌环直径的影响(略)注：表中对照为阳性对照
表1显示，匙羹藤提取物浓度为50 mg/mL，在M-H琼脂平板上对金黄色葡萄球菌、变形杆菌及大肠杆菌标准菌株的抑菌环直径均大于7 mm，显示出其抑菌作用，但对绿脓杆菌抑菌效果较差，抑菌圈直径小于或等于7 mm。所有阴性对照无抑菌环产生。表2 匙羹藤提取物的抑菌作用（略）注：“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长
表2结果表明，匙羹藤提取物对金黄色葡萄球菌最为敏感，而对大肠杆菌和变形杆菌的抑菌效果也可。匙羹藤提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌标准菌株的MIC分别为0.625、1.25、1.25、2.5 mg/mL。
4 讨论
目前，国内外对匙羹藤的化学成分和药理作用研究非常活跃。匙羹藤主要含有皂苷、萜类、黄酮、多肽、果胶、生物碱等成分，其提取物的有效成分主要是匙羹藤酸(gymnemic acide)。
为观察中药匙羹藤是否有抑菌作用以及抑菌作用如何，首先我们对匙羹藤的有效成分进行了提取，然后对临床常见多种细菌的标准菌株进行预试验，发现匙羹藤提取物对金黄色葡萄球菌、变形杆菌及大肠杆菌的抑菌环直径均大于7 mm，显示出抑菌作用，而对绿脓杆菌抑菌效果较差，其抑菌环直径等于或小于7 mm。我们又对匙羹藤提取物进行了进一步研究，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌及绿脓杆菌的MIC分别0.625、1.25、1.25、1.25 mg/mL。通过研究发现匙羹藤提取物对多种细菌有抑制效果，说明其抑菌谱范围较广。
本试验仅为标准菌株的体外抑菌实验，但匙羹藤对临床菌株抑菌作用如何，我们将进行下一步的研究证实；匙羹藤提取物是否有杀菌作用以及杀菌成分是否为匙羹藤酸等也有待进一步的研究。匙羹藤有效成分的提取方法目前还不太成熟，本试验只采用了乙醇进行提取，对有效成分提取的最佳方法以及有效成分的研究还需进一步探索。
参考文献
1] 江苏植物研究所.江苏植物志[M].南京：江苏科学技术出版社，1982. 431－432.
[2] 武雪芬，白 雁.金银花叶药用成分的提取及抑菌实验研究[J].中成药， 2001，23(6)：448－449.
[3] 姚淑敏.黄芪提取物对细菌抑制作用的研究[J].食品科学，2006， 27(8)：91－93.
[4] 王桂亭.无花果叶提取物抑菌作用的实验研究[J].中国消毒学杂志， 2003，22(4)：374－376.
[5] 李仲兴.用新的中药抑菌实验方法进行五倍子对252株临床菌株的抑菌效果观察[J].中国中医药信息杂志，2000，7(9)：26.