作者：张国民 齐赤虹 杨工昶 李志军
【摘要】 ：目的 建立高效液相色谱法测定复方益母胶囊中阿魏酸含量的方法。方法 采用ZORBAXSB-C18色谱柱，流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液(12︰88)，检测波长为316 nm，流速为1.0 mL/min。结果 阿魏酸在0.8～13 μg/mL范围内呈良好的线性关系(r＝0.999 99，n＝6)，平均回收率为103.0%(RSD＝0.4%，n＝5)。结论 本法简单可行，准确度高，重现性好，回收率高，能有效控制复方益母胶囊的质量。
【关键词】 复方益母胶囊 阿魏酸 高效液相色谱法
Abstract：Objective To estblish a HPLC method for content determination of ferulic acid in compound prescribe Motherwort Herb capusle. Method The column ZORBAXSB-C18 was used with Acetonitrile-0.2% phosphoric acid aqueous solution (12∶88) as mobile phase， and detective wavelength was 274 nm， the flow rate was 1.0 mL/min. Result Within the range of 0.8～13 μg， ferulic acid presented a fine linear relationship (r＝0.999 99， n＝6). The average recovery was 103.0% (RSD＝0.4%， n＝5). Conclusion The method is suitable， accuracy is high and reproducibility is good， recovery is high， and can control the quality of compound prescribe Motherwort Herb capusle.
Key words：compound prescribe Motherwort Herb capsule；ferulic acid；HPLC
复方益母胶囊是原益母冲剂(WS3-B-1812-94)的改进剂型，由益母草、当归、川芎、木香4味药组成，具有活血调经、行气止痛的功效，用于气滞血瘀、月经不调、痛经、产后瘀血腹痛的治疗。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》[1]，其中无含量测定方法。本品处方中含有当归与川芎[2]，均含有阿魏酸，结合本品的功能主治及制法，故笔者确定以阿魏酸为检测指标，采用高效液相色谱法测定成品中阿魏酸的总含量。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器)；MILLIPORE Simplicity超纯水器；超声波清洗器(型号CX-250，功率250 W，频率33 kHz，北京医疗设备二厂)；电子天平[Metler-AE240型 梅特勒-托利多(上海)有限公司]。
乙腈(色谱纯，批号031123，Fisher)，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。阿魏酸对照品(购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号773-9910)；复方益母草胶囊由开封市民康制药厂提供(批号040201，040202，040203，040204，040205， 040206，040207，040208，040209，040210)。
2 色谱条件
色谱柱：ZORBAXSB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液(12︰88)；检测波长：316 nm；流速：1.0 mL/min。
3 方法和结果
3.1 对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品2.04 mg到100 mL量瓶中，稀释至刻度，制成阿魏酸对照品贮备液。
3.2 提取方法的选择
根据阿魏酸的化学性质，考察回流和超声两种提取方法。取本品内容物(批号040201)约1.6 g，2份，精密称定，分别精密加入甲醇30 mL，称定重量，分别回流提取、超声处理30 min后，补足失重，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别吸取上述2种供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件依法测定。结果表明，超声处理率最好，且该法操作简单，故确定采用超声方法提取。
3.3 溶剂种类的选择
取本品内容物(批号040201)约1.6 g，3份，精密称定，分别精密加入50%甲醇、70%甲醇、甲醇各30 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别吸取上述供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件依法测定。结果表明，以70%甲醇为溶剂，阿魏酸的提取效率最好，故确定提取溶剂为70%甲醇。
3.4 提取时间的选择
取本品内容物(批号040201)约1.6 g，3份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，称定重量，分别超声处理30、45、60 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别吸取上述供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件依法测定，结果表明，超声处理45 min即可提取完全。
3.5 溶剂用量的考察
取本品内容物(批号040201)约1.6 g，3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70%甲醇(20、30、50 mL)，密塞，称定重量，超声处理45 min，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别吸取上述供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件依法测定，结果表明，30 mL溶剂即可将阿魏酸提取完全。
3.6 供试品溶液的制备
取本品内容物1.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，称定重量，超声(功率250 W，频率33 kHz)处理45 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.7 空白试验
取益母草加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；除当归、川芎外其余一味木香，用50%乙醇回流提取2 h，滤过，滤液回收乙醇后与上述清膏合并，浓缩成稠膏状，加蔗糖及乙醇适量，制成颗粒，整粒，装胶囊，即得空白对照品，并按供试品溶液制备方法制得空白溶液。精密量取阿魏酸贮备液1 mL，置50 mL量瓶中，用10%乙醇稀释到刻度，制成对照品溶液。分别精密吸取上述2种溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，结果见图1。试验结果表明，空白无干扰。
3.8 线性关系考察
精密称取阿魏酸对照品2.04 mg，置100 mL量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成阿魏酸对照品贮备液。再精密量取贮备液适量，制成不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积积分值为横坐标、阿魏酸进样浓度(mg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y(mg/mL)＝0.000 001 418 12＋0.000 008 005 09X (r＝0.999 99，n＝6)。结果表明，阿魏酸在0.8～13 μg/mL范围内呈良好的线性关系。
3.9 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液(0.000 408 mg/mL)各20 μL，连续进样5次，记录峰面积，计算，RSD＝0.27%。试验结果表明，仪器精密度良好。
3.10 稳定性试验
称取本品内容物1.632 g，置三角瓶中，加70%甲醇30 mL，超声处理45 min，放冷，补重，滤过，分别于0、2、4、6、8 h精密吸取续滤液20 μL，注入液相色谱仪，依法测定，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。
3.11 重复性试验
按“3.6”项下供试品溶液的制备方法，分别称取同一批号样品约1.6 g，6份，依法操作，测定阿魏酸含量，计算相对标准偏差，结果平均含量为0.062 mg/g，RSD＝1.12%，表明重复性良好。
3.12 样品测定
取10批中试样品，按“供试品溶液的制备”项下方法及色谱条件测定，结果见表1。表1 样品含量测定结果（略）
根据以上10批含量测定结果，暂定本品每粒含当归和川芎总量以阿魏酸(C10H10O4)计，不少于18.3 μg。
3.13 回收率试验
采取加样回收法(按1∶1加入)，取已知含量的同一批号样品(批号040201)约0.8 g，精密称定，分别精密加入阿魏酸对照品溶液(2.04 mg→100 mL)各2.5 mL，再分别加入70%甲醇27.5 mL，其它按“3.6”项下供试品溶液制备方法及色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。试验结果表明，阿魏酸的加样回收率在95%～105%之间，加样回收良好。表2 回收率试验结果（略）
4 小结
复方益母胶囊收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中，无相应的含量测定指标，王氏[3]采用HPLC法、赵氏等[4]采用薄层扫描法测定阿魏酸含量，但缺点是重复性差、精密度低，测定结果不准确。我们经过分析试验研究，选用HPLC法测定方中阿魏酸的含量。该方法操作简单，准确度高，重现性好，能够有效测定成品复方益母胶囊中当归和川芎的有效成分阿魏酸，同时确保对成品的有效及时质量监控，为进一步的研究提供依据。
参考文献
[1] 中华人民共和国卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准[S].WS3-B- 1812-94.
[2] 钱 芳，燕恩慈.川芎中阿魏酸定性定量的薄层色谱扫描法[J].中成药， 1990，12(4)：9－10.
[3] 王 兰.采用高效液相法测定柏子养心丸中阿魏酸的含量测定[J].陕西中医，2004，25(7)：650－652.
[4] 赵春香，章贵杰.薄层扫描法测定脑痛平胶囊阿魏酸含量[J].中国中药杂志，1997，22(4)：226－227.