【摘要】 ：目的 探讨电针对慢性应激模型大鼠抑郁状态相关行为学的影响及其作用机制。方法 40只SD大鼠分为空白组、模型组、电针组和氟西汀组，应用慢性复合应激方法造模，进行抑郁状态相关行为学检测，包括Open-field实验、强迫游泳实验和“Y”迷宫实验。免疫组化方法检测海马内糖皮质激素受体(GR)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR)2B的表达情况。结果 与空白组比较，模型组大鼠的探究活动减少(P&<0.01)，学习记忆能力降低(P&<0.01)，电针组大鼠相应行为学实验比模型组有显著提高(P&<0.01)；模型大鼠海马内GR、NR2B阳性表达强度显著降低(P&<0.01)，电针组海马内NR2B的阳性表达强度有所提高(P&<0.01)，而GR也表现出升高的趋势。结论 电针可以减轻慢性应激引起大鼠抑郁状态的程度，其机制可能与脑内GR、NR2B表达变化有关。
【关键词】 电针 抑郁 糖皮质激素受体 N-甲基-D-天冬氨酸受体2B 大鼠
Abstract：Objective To investigate the influence of electroacupuncture (EA) on behaviors and GR， NR2B in hippocampal of the chronic stress depression rats. Methods Forty SD rats were pided into control， model， EA and Prozac groups. Chronic stress model was established by using chronic mixed stimulation. Observe the behaviors caused by chronic stress， including changes of spontaneous movements in Open-field test， learning-memory behavior in“Y”-maze test and stillness time in forced-swimming test. The expression of GR and NR2B in hippocampal tissue was detected by immunohistochemical technology. Results Compared with control group， the results of spontaneous movements， stillness swimming time and learning-memory behaviors of the chronic stress model rats were declined significantly (P&<0.01)， which of EA group were improved compared with model group (P&<0.01). The expression of GR and NR2B in hippocampal of model rats was declined significantly compared with control group (P&<0.01)， and NR2B was increased in EA group (P&<0.05， P&<0.01)， GR also showed the intend to be increased. Conclusion EA could reduce the changes of behaviors which were caused by chronic stress， the possible mechanism of it might related to the changes of expression of GR and NR2B in the hippocampl.
Key words：electroacupuncture；depression；GR；NR2B；rat
体内糖皮质激素的分泌具有自身逆反馈调节的特点，其分泌主要受HPA轴(下丘脑-垂体前叶-肾上腺皮质轴)调节，糖皮质激素在血液中浓度的增加反过来又可以抑制下丘脑和垂体前叶，从而减少糖皮质激素的分泌。海马中富含糖皮质激素受体(GR)，可以抑制应激条件下HPA轴的过度反应。创伤性应激和慢性应激均可导致海马GR含量改变，报道中创伤性的应激主要引起海马GR表达的升高[1]；慢性应激损伤实验显示，应激早期海马内GR表达增强，慢性应激后期阳性表达减少[2]。海马GR除了可以自我调节，还受到N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR)的影响，两者都对HPA轴和海马神经元长时程增强效应(LTP)有影响，参与应激和学习记忆[3]。本实验观察慢性应激对大鼠一系列行为学活动的影响效应，包括自主运动、强迫运动和学习记忆活动，同时观察电针对这一过程的干预作用。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
雄性SD大鼠，体重160～180 g(北京维通利华实验动物养殖中心)，筛选40只，随机分为4组，每组10只，分别为空白组、模型组、电针组、氟西汀组。
1.2 主要仪器和药物
Noduls Ethovision软件及摄像系统(荷兰Noldus information technology公司，型号NOVELBAC)；MG-3Y迷宫刺激器(张家港生物医学仪器厂)；HANS Lh302H型电针仪(北京华威有限公司)。氟西汀(百优解，美国礼来公司，批号A019602)。
1.3 造模
造模各组孤养并每日随机给予以下刺激的1种：断食(24 h)、断水(24 h)、昼夜颠倒(24 h)、夹尾(3 min)、束缚(3 h)、10 ℃冷水游泳(5 min)、电击足底(电压为30 V，电击5 s，间歇5 s，共进行300 s)，共21 d。
1.4 治疗组处理方法
电针组选取“百会”和“印堂”两穴，使用HANS 202型电针仪，电针频率为2 Hz，电流强度3 mA，每次30 min，每日1次。造模同时给予治疗，共21 d。氟西汀组于每日进行应激刺激前1 h灌胃给药，用药量为1.8 mg/kg，按1 mL/100 g给药，共21 d。
1.5 行为学检测
1.5.1 Open-Field实验
使用Noduls Ethovision 软件及摄像系统对大鼠3 min内在小箱中进行的总路程、站立次数进行记录。每只大鼠行为的检测在区域为80 cm×80 cm的开放场内，由红外摄像系统和视频合成器记录大鼠的活动情况，计算机分析系统分析大鼠的运动轨迹。
1.5.2 强迫游泳实验
于开野实验后立即将大鼠放入14 ℃冷水中游泳，以大鼠四爪均不动记为游泳不动时间，每只动物测定1次，每次测定5 min。
1.5.3 “Y”型电迷宫实验
应用MG-3Y迷宫刺激器，测试成绩分为学习成绩和记忆成绩。宫箱设有3条通道，每臂末端有信号灯，箱底通以交流电。灯光指示为安全区，不通电。将大鼠置于一支臂端，另两支任意一支给灯光信号，示安全区。适应1 min后给予电击，以大鼠直接逃至安全区为正确反应，否则为错误。学习成绩以大鼠达到连续9次以上正确反应时所需的电击总次数为准，记忆成绩以学习完后再电击10次中正确反应的次数(N/10)为准，于应激前后记录测试成绩。
1.6 GR、NR2B免疫组化染色和图像分析 1.7 统计学方法 所有数据用—x±s表示，用独立样本t检验做组间差异显著性分析；图像分析结果用多个样本比较的秩和检验(Kruskal- Wallis法)和多个样本两两比较的秩和检验(Nemenyi法)。 2 结果 2.1 电针对大鼠强迫游泳实验的影响 (见表1)表1 各组大鼠应激前后游泳不动时间比较(略)注：与空白组比较，*P&<0.01；与模型组比较，#P&<0.05，##P&<0.01； 2.2 电针对大鼠“Y”型电迷宫实验的影响 (见表2)表2 各组大鼠应激前后学习记忆成绩比较(略) 2.3 电针对大鼠Open-Field实验的影响 (见表3)表3 各组大鼠应激前后Open-Field活动性比较(略) 2.5 电针对大鼠海马内NR2B阳性表达强度的影响 表达情况基本与GR一致，但阳性表达密集的区域主要有CA1、CA3区，具体情况见表5。表5 海马各亚区NR2B免疫组化阳性表达强度统计结果注：Hc=10.30，v=3，P&<0.05(略) NMDA受体被认为是突触可塑性及皮质和海马神经元长时程增强效应(Long-term potentiation，LTP) 的主要调控者，构成了中枢神经系统的重要功能(如学习和记忆的基础)，而LTP的损害与一些应激过程紧密相关。近年来的研究发现，其与中枢神经系统的许多高级活动，特别是脑的认知功能密切相关。《自然》杂志上的一篇文章将NR2B命名为“聪明基因”，提出了该基因就是记忆基因的新论点[4]。 过度的应激会引起机体出现应激紊乱，会导致严重的继发性损害，例如对周围事物的兴趣降低、生存欲望和学习记忆能力下降等。海马内富含两种肾上腺皮质激素受体：盐皮质激素受体(MR)和糖皮质激素受体(GR)，MR主要参与基础水平的HPA轴的调节，GR则抑制应激条件下HPA轴的过度反应[5]。GR的调节与NR2B介导的突触传递有着某种密切联系。从应激的角度看，海马是HPA轴调节的高位中枢，是应激累及的敏感部位；从学习记忆的角度来看，海马是参与学习记忆的重要部位，而海马的这些作用均有GR和NR2B的介入[6]。 本实验研究慢性应激下GR与NR2B之间的作用关系，结果显示，慢性应激使大鼠海马内GR的表达强度降低，而同时NR2B的表达强度也降低。对于GR表达降低的解释可能是一种过度刺激产生的脱敏反应，就是当机体受到应激原刺激的早期，内源性糖皮质激素（GC）水平升高，而GR也随之增高，当应激原持续存在，累计强度过大、持续时间过长时，GC始终保持较高水平，导致GR敏感度降低，免疫强度减弱，继而耗竭而表达减少。海马GR表达降低，使得其对HPA轴的负反馈作用减弱，加重机体的损伤反应。 有实验显示，慢性复合应激后，NR2B在海马内表达与对照组比较，细胞排列更密集，且表达强度也略有改变，以CA3区最强[7]。本次实验的结果表明，在慢性应激的情况下GR表达降低的同时NR2B活性增强，与之前结果似有不符。这一结果提示如下问题：在慢性应激的条件下是否存在另一条通路可以影响GR的含量下降，并且NMDAR通道的一系列病理性效应，如兴奋性毒性，在应激的后期是否还继续存在，这些有待于进一步研究。 【参考文献】
断头后迅速取脑并切取含海马脑段，浸入4%多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，额状连续切片，片厚5 μm，每只动物间隔取片，每个指标取3张，常规SABC法染色：常规脱蜡和水化，兔抗GR、NR2B单克隆抗体(1∶100，北京博奥森生物技术有限公司)室温60 min，生物素标记二抗室温孵育15 min，链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液室温15 min，DAB溶液显色(以上SP超敏试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供)。光镜下，归类每张切片海马CA1、CA2、CA3、齿状回等4个亚区的阳性细胞强度，以每100个细胞中阳性细胞个数为标准，分为阴性(n＝0)、弱阳性(0
与电针组比较，▲P&<0.01(下同)
2.4 电针对大鼠海马内GR阳性表达强度的影响
光镜下可见海马细胞阳性表达呈褐色，位于细胞质内，多见于锥体细胞层，个个亚区都有一定表达，但主要分布于海马CA1区。具体表达情况见表4。表4 海马各亚区GR免疫组化阳性表达强度统计结果注：Hc=40.57，v=3，P&<0.01(略)
3 讨论
[1] 王庆松，王正国，朱佩芳.创伤后应激障碍样行为异常大鼠海马糖皮质激素与盐皮质激素受体表达研究[J].中华创伤杂志，2003，19(3)：179－182.
[2] 陈家旭，杨建新，赵 歆，等.岳广欣慢性束缚应激大鼠中枢糖皮质激素受体变化及中药复方的影响[J].中国应用生理学杂志，2005，21(4)：402－406.
[3] 赵 刚，蔡定芳.应激、糖皮质激素和海马老化[J].国外医学·老年医学分册，2002，23(3)：125－128.
[4] Bliss TV. Yong receptors make smart mice[J]. Nature，1999，400：25－27.
[5] DeKloet ER， Vreugdenhil E， Oitzl MS， et al. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease[J]. Endocr Rev，1998， 19(3)：269－301.
[6] Sakimura K， Kutsuwada T， Ito I， et al. Reduced hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor repsilon 1 subunit[J]. Nature，1995，373：151－155.
[7] 程少容，刘能保，张敏海，等.慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马NMDA受体亚基NR2A和NR2B表达的影响[J].神经解剖学杂志，2004， 20(3)：275－280.