作者：景明 李季文 樊秦 师霞
【摘要】 ：目的 建立湿生扁蕾药材中木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脱，0～15 min，A∶B＝50∶50，15～60 min，A∶B＝55∶45；检测波长260 nm；流速1 mL/min；柱温30 ℃。结果 1，7-二羟基-3，8-二甲氧酮和木犀草素分别在0.084～0.84 μg和0.184～1.84 μg范围内线性关系良好，相关系数分别为0.999 4和0.999 7；平均回收率分别为96.82%和97.19%，RSD均小于3%。结论 该方法简便准确，重现行好，可作为湿生扁蕾药材的质量控制方法。
【关键词】 湿生扁蕾 1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮 木犀草素 反相高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish the determination of luteolin and 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone in Herbal Gentianopsis paludosa. Method The RP-HPLC with ZORBAX SB-C18 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) comlum was used. Mobile phase was methanol (A)-0.4% H3PO4 (B) Gradient elution was used， 0～15 min， A∶B＝50∶50， 15～60 min， A∶B＝55∶45. Detection wavelengh was 260 nm. Flow rate was 1.0 mL/min. Temperature of column was 30 ℃. Result The linear relationship of 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone and luteolin were showed at the range of 0.084～0.84 μg and 0.184～1.84 μg (r＝0.999 4 and r＝0.999 7). The average recovery rate of 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone and luteolin were 96.82% and 97.19%， RSD&<3%. Conclusion The method was accurate， reproducible and can be used to control the quality of Gentianopsis paludosa.
Key word：Gentianopsis paludosa；1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone；luteolin；RP-HPLC
湿生扁蕾Gentianopsis paludosa (Mum.) Ma为龙胆科扁蕾属一年生草本植物。具有清热解毒、利湿消黄、健脾止泻等功能，用于肝炎、胆囊炎、热病发斑、目赤肿痛、消化不良、肠胃炎等[1]。由于受诸多因素的制约，致使目前藏药材使用不规范，缺乏理化控制标准，因此，加强藏药材质量标准基础性研究，是保证和提高藏药标准化、规范化，进一步开发藏药以及发展民族医药事业的重要课题。湿生扁蕾主要含有酮类、黄酮类、三萜类化合物[2]，酮类和黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌、护肝等生物活性[3-4]，其中木犀草素是湿生扁蕾抗腹泻活性成分，而1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮是湿生扁蕾抗菌活性成分[5-6]，所以，选择这两种成分进行含量测定，为湿生扁蕾药材的质量控制提供可行的方法。
1 仪器与试药
Agilent HP1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AE-240电子天平(瑞士布奇)；KQ-100超声波清洗器(昆山市超声技术有限公司)；R-200旋转蒸发仪(瑞士布奇)。
木犀草素对照品(批号111520-200201)购自中国药品生物制品检定所；1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品(自提，HPLC归一化法测定纯度达98%以上)；湿生扁蕾药材经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为Gen tianopsis pa ludosa Ma。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脱，A∶B＝50∶50(0～15 min)，A∶B＝55∶45(15～60 min)；检测波长260 nm；流速为1.0 mL/min；柱温30 ℃。理论塔板数均大于3 000。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液制备
精密称取木犀草素对照品2.1 mg、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品4.6 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取1 mL，用甲醇定容至5 mL量瓶中，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备
精密称取湿生扁蕾药材粉末1 g，用50 mL丙酮回流提取4 h，提取水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液2、4、8、10、12、16、18、20 μL，进样测定，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的回归方程分别为：Y＝84.526X－49.163，r＝0.999 4和Y＝112.431X－117.129，r＝0.999 7。结果木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮分别在0.084～0.84 μg和0.184～1.84 μg范围内线性良好。
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，重复进样5次，结果木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的RSD分别为1.63%和0.97%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取同一样品溶液，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h各进样10 μL，木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的RSD分别为2.71%和1.33%，表明样品溶液在12 h内稳定。
2.7 重复性试验
精密称取同一批湿生扁蕾药材1 g，共5份，分别按“2.3”项下方法制备样品溶液，各取10 μL进样测定，结果木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的RSD分别为2.79%(平均含量0.051%)和1.36%(平均含量0.167%)。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的湿生扁蕾药材(木犀草素含量：0.51 mg/g、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮含量：1.67 mg/g) 0.5 g，共6份，每份精密加入一定量的木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品，按“2.3”项下方法制备样品溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表1、表2。表1 木犀草素回收率试验结果（略）表2 1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮回收率试验结果（略）
2.9 样品含量测定
取5批湿生扁蕾药材样品，按“2.3”项下方法制备供试品品溶液。分别精密吸取10 μL，按上述色谱条件测定，结果见表3。表3 样品含量测定结果（略）
3 讨论
首次通过RP-HPLC法测定了湿生扁蕾药材中木犀草素和1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的含量，为湿生扁蕾药材的质量控制提供可行的方法。
在选择提取溶剂时，对甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯进行了比较，结果发现，用丙酮作提取溶剂不仅效率高而且杂质少。
流动相用甲醇-水(55∶45)等度洗脱时木犀草素的分离效果差，与相邻峰分不开，而用甲醇-水(50∶50)等度洗脱时，分离的时间又偏长。因此，选用梯度洗脱，且在水中加入少量的磷酸，使峰的对称性得以改善，分离效果提高。
参考文献
[1] 张宝琛，甄润德，胡柏林，等.湿生扁蕾的化学成分研究[J].中草药， 1980，11(4)：149.
[2] 王焕弟，谭成玉，杜昱光，等.藏药湿生扁蕾的化学成分研究[J].中国药学杂志，2005，40(14)：1059.
[3] 李作平，霍长虹，郑小莉.扁蕾的化学成分研究[J].中国现代应用药学杂志，2003，20(1)：24.
[4] 米 琴，曹长年，赵宙光，等.藏药湿生扁蕾有效成分的研究[J].青海师范大学学报(自然科学版)，2005，23(2)：64.
[5] 米 琴，曹长年，王慧春，等.湿生扁蕾有效成分抑菌活性的测定[J].青海师范大学学报(自然科学版)，2004，22(2)：84.
[6] 王焕弟，谭成玉，白雪芳，等.藏药湿生扁蕾有效成分抑菌作用初探[J].天然产物研究与开发，2005，17(5)：598