作者：张娟 李娟 赵毅 余克强
【摘要】 ：目的 观察青藤碱对体外培养类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖以及基质金属蛋白酶-3(MMP-3)mRNA含量的影响。方法 培养人成纤维样滑膜细胞，分为青藤碱高、中、低剂量组和空白对照组，经青藤碱干预后，用四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖情况，用半定量RT-PCR方法检测成纤维细胞中MMP-3 mRNA的表达。结果 经青藤碱干预后的人成纤维样滑膜细胞的增殖率受到显著抑制(P&<0.05)，其中高剂量组的改变差异尤为显著(P&<0.01)。MMP-3的mRNA表达水平较之空白对照组有显著下降(P&<0.05)，且高剂量组的差异尤为显著(P&<0.01)。结论 青藤碱可以抑制类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞的增殖并下调MMP-3的表达，推断这可能是青藤碱治疗类风湿关节炎的一种机理。
【关键词】 类风湿关节炎 青藤碱 成纤维样滑膜细胞 基质金属蛋白酶-3
Abstract：Objective To observe the effect of sinomenine on the proliferation of fibroblast-like synoviocytes (FLS) and expression level of MMP-3 secreted by FLS in rheumatoid arthritis in vitro. Methods FLS were obtained by digesting synovial tissues with collagens and were pided into four groups：sinomenine high， middle， low concentration and control group. The proliferation of FLS was assessed by methyl- thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay and the mRNA expression of MMP-3 was measured by semi-quantitative RT-PCR respectively after treated by sinomenine. Results The rate of FLS proliferation was significantly reduced in groups treated by sinomenine. Compared with control group， the mRNA expression of MMP-3 markly decreased in sinomenine groups (P&<0.05) and especially in sinomenine high group (P&<0.01). Conclusion Sinomenine can effectively inhibit the proliferation of FLS and reduce the mRNA expression of MMP-3 of FLS in rheumatoid arthritis， that may be a mechanism in therapy of rheumatoid arthritis by sinomenine.
key words：rheumatoid arthritis；sinomenine；fibroblast-like synoviocytes；MMP-3
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。病变关节主要表现为炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成以及由此引发的软骨、骨和关节囊的损伤，最终可以导致关节的畸形和功能丧失。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes， FLS)是一种可以在RA的发病中引起关节损害的主要效应细胞。FLS分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)是一族锌离子依赖性的内源性蛋白水解酶，可以直接降解软骨和骨质从而对关节造成破坏。由于许多外来信息都必须首先激活MMP-3后才能活化其它MMPs，所以，FLS分泌的MMP-3在关节破坏过程中所起的作用非常重要[1]。研究表明，青藤碱(sinomenine，SIN)治疗RA具有较明确的疗效，具有抗炎、免疫抑制、镇痛等药理作用，且毒副作用较小，临床上得到了广泛的应用[2]。但是，SIN对于RA患者FLS分泌的MMP-3作用尚不清楚。本实验就SIN对RA患者FLS的增殖以及其MMP-3的mRNA表达进行研究。
1 材料与方法
1.1 标本取材
RA滑膜均取材于南方医院脊柱骨科因RA行全膝关节置换术或关节镜滑膜切除术患者的关节滑膜组织，所有患者均符合1987年美国风湿病学会修订的RA分类标准[3]，患者对取材均知情同意。
1.2 主要材料和仪器
超净工作台、普通离心机、CO2培养箱、荧光倒置显微镜、酶联仪(BIO-RAD Model 550)、PCR仪(Perkin Elmer公司)。SIN干粉(含量98%，性状为白色粉末)由湖南正清公司提供；高糖DMEM培养基、胰蛋白酶均购自GIBICO公司；胎牛血清(FBS)、胶原蛋白酶、EDTA、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自Sigma公司；Trizol试剂、引物(上海生物工程技术服务有限公司)；RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。
1.3 人成纤维样滑膜细胞的分离培养
手术中获得的滑膜组织，在无菌条件下用D-Hanks液洗涤3～4次，剔除脂肪组织后获得白色滑膜组织，修剪收集的滑膜组织的滑膜层，充分剪碎，加入胶原酶消化，用含10% FBS的DMEM，直接分散贴附于培养瓶底部，置CO2培养箱(5% CO2、37 ℃)培养。3～4 d更换培养基，去除未贴壁的组织块，以后2～3 d更换1次培养基。利用光学显微镜对人FLS进行鉴定，待长满培养瓶底后，用0.25% 胰酶-0.02% EDTA混合消化液消化，传代分瓶培养，以第2～5代FLS进行实验。
1.4 人成纤维样滑膜细胞的药物干预及分组
将SIN溶于DMEM基础培养基中，按照
参考文献
[4]方法设立高、中、低剂量组，配制成浓度分别为0.3、0.1、0.05 mmol/L的SIN溶液。在传代后培养的第3天分别按照高、中、低浓度加入SIN溶液，对照组加入等量DMEM培养液，于培养第8天收获。采用光镜观察鉴定滑膜细胞。 1.5 MTT法检测细胞增殖
取处于对数生长期的FLS，用含有0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA的消化液反复吹打，制成细胞悬液，用锥虫蓝拒染法检测细胞活力&>95%。将细胞悬液1 000 r/min、离心5 min后弃上清，各组细胞用含有血清的DMEM培养基分别稀释至5×106/L。细胞悬液接种于24孔板，每孔加入800 μL，12 h后换液，用按照0.3、0.1、0.05 mmol/L配制好的含有高、中、低不同浓度SIN的DMEM培养液对各组细胞进行培养，空白对照组加入等量的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2进行培养。按照文献[5]方法，在第8天用MTT比色法测定各组的A值均值，记录并计算不同浓度组和空白对照组对FLS的抑制率[抑制率(%)＝1－试验组A值/对照组A值均值×100%]。
1.6 细胞总RNA提取
采用Trizol一步法提取人滑膜细胞的总RNA，经紫外分光光度计测量260 nm和280 nm吸光度，二者比值在1.7～1.9之间。
1.7 逆转录聚合酶链式反应
取2 μg总RNA，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min；进行30个周期的PCR逆转录后，进行PCR扩增，以β-肌动蛋白(β- actin)作为内对照。采用DNAman软件设计引物，引物序列及扩增产物长度见表1。表1 MMP-3与β-actin引物序列（略）
按照宝生物工程(大连)有限公司RT-PCR试剂盒(AMV)说明进行PCR扩增。扩增参数设置如下：94 ℃ 2 min预变性1个循环，每个周期为94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min。取PCR产物置于2% 琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，电泳条带经Hema凝胶图像分析系统作条带密度扫描，结果以MMP-3与β-actin密度比值作为MMP-3表达参数，对MMP-3 PCR产物相对定量。
1.8 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，结果以x±s表示，各组数据经过正态检验和方差齐性检验后，进行单因素方差分析，P&<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 人成纤维样滑膜细胞的培养鉴定
胶原酶消化法培养的人FLS在培养1周后在倒置显微镜下可见组织块周围呈放射状生长，10 d见细胞开始脱离组织块呈梭形生长且连成网状，2周左右细胞成片生长，3周细胞长满瓶底，且细胞排列整齐，呈现明显的方向性；传代后的细胞在12 h内完全贴壁，初期呈网状分布生长，以后随细胞数量的增长逐渐紊乱无明显的方向性，细胞形态以梭形为主，交织成网，网间散布有较多多边形细胞。在光镜下可观察到：细胞呈卵圆形、梭形或柱形，有短突起， 核呈卵圆形位于细胞中央，有时可见多核巨噬细胞样细胞，生长良好，纯度高，细胞形态无改变。
2.2 青藤碱对人成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响
实验结果显示，较之于空白对照组，不同浓度试验组的细胞增殖均受到明显抑制(P&<0.05)，其中高浓度剂量组的细胞增殖受到的抑制最为明显(P&<0.01)。见表2。表2 各组对FLS增殖抑制率的影响(略) 注：与空白对照组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与SIN低剂量组比较，
△P&<0.05(下同)
2.3 RT-PCR检测的结果
MMP-3的mRNA经逆转录聚合酶链式反应扩增后的扩增产物大小与预期一致。Hema凝胶图像分析系统作条带密度扫描显示，MMP-3与β-actin产物的OD比值，SIN高剂量组与空白对照组之间存在显著差异(P&<0.01)，低剂量组与空白对照组之间差异有显著性(P&<0.05)，表明SIN对人滑膜细胞MMP-3的表达具有抑制作用。其检测结果见图1、表3。表3 RA患者FLS中MMP-3 mRNA的表达(略)
3 讨论
RA以持续存在的滑膜炎为特点，其慢性滑膜增生主要表现为滑膜衬里层细胞增生、炎性细胞浸润以及滑膜下层血管生成，进而导致关节组织包括肌腱、关节囊、软骨和骨进行性和不可逆性破坏以及功能障碍。FLS是关节滑膜细胞中的一种主要细胞，可以根据环境的变化发生演变，存在异常的增殖与分泌。研究证实，在体外分离和培养的情况下，滑膜各层的FLS和血管翳细胞几乎没有区别[3]。FLS不但参与滑膜组织对关节软骨及关节周围骨组织的破坏，而且还分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1等，相互作用，构成细胞因子网络，持续刺激滑膜细胞，使得关节软骨过度增殖，刺激炎症反应，间接导致关节软骨的破坏[1]。这些都提示FLS是一种可以引起关节损害的主要效应细胞。RA的关节组织破坏主要是结缔组织的细胞间质降解以及溶解的结果。而结缔组织细胞间质以及软骨的降解和溶解长期以来被认为与细胞因子刺激下软骨和滑膜细胞产生的MMPs有关[6]。MMPs是一组在结构上具有极大同源性、能降解细胞外基质蛋白的内肽酶的总称。MMPs对RA的关节破坏作用可以概括为两个途径，一是直接降解软骨和骨质，二是在血管生成方面具有重要作用，这是RA的显著特征[7]。在RA的早期，增生的滑膜组织在向关节软骨面生长的同时侵蚀关节软骨，形成血管翳，血管翳中含有大量的成纤维细胞，可以释放胶原蛋白酶、MMP-3等[8]；同时，FLS在一些细胞因子的刺激下也可以分泌MMP-3，进而激活胶原蛋白酶，通过滑液作用于无血管翳附着的软骨进而引起骨组织的破坏。这种分泌的MMP-3也是一种对基质起广泛作用的蛋白酶，被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶，它对RA关节的破坏作用主要在于软骨和骨质[8]。有研究证实，滑膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞都可以分泌MMP-3，其活化可以导致软骨连接蛋白、纤维连接素以及多种胶原酶等蛋白酶的降解，被认为是降解关节软骨最为关键的蛋白酶[7]。所以，MMP-3在RA中的研究近年来也得到了越来越多学者的重视。
研究发现，RA患者血清中的MMP-3水平显著高于正常对照组，而且其水平的升高与RA的活动性有关[9]。同时还发现，RA患者关节滑液中MMP-3含量明显增高而且其滑膜中的MMP-3蛋白和基因均处于过度表达状态[10]。所以，抑制FLS增殖已成为治疗RA的重要手段之一。在对RA患者关节滑膜液中的糖蛋白降解产物进行进一步的分析中发现，其核心蛋白成分都是在对MMP-3易感的位点处被裂解[11]。这些也都提示，MMP-3在RA关节的破坏中起着极为重要的作用。
我们研究发现，RA患者滑膜组织是大量增生的，SIN可以显著抑制FLS的增殖，同时，SIN还可以显著抑制MMP-3的mRNA表达，且实验初步表明，高剂量组较之低、中剂量组的抑制效果更加明显(P&<0.01)。提示SIN可以通过抑制RA患者FLS的增殖以及降低其MMP-3的mRNA表达而抑制关节滑膜组织的降解，减轻RA患者关节的破坏作用。
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