【摘要】 ：目的 观察益气化瘀中药对大鼠胃癌前病变胃黏膜蛋白激酶C(PKC)、细胞周期素E(CyclinE)表达的影响。方法 采用甲硝基亚硝基胍(MNNG)、乙醇、饥饱失常等多因素造模。造模成功后，将造模存活大鼠随机分为自然恢复组及中药高、中、低剂量组，各组大鼠做相应的处理后，免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜组织PKC、CyclinE表达水平。结果 各治疗组PKC表达及CyclinE蛋白阳性率较自然恢复组下降，有显著差异(P&<0.05)。结论 益气化瘀中药可能是通过下调PKC及CylinE的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。
【关键词】 胃癌前病变 蛋白激酶C 细胞周期素E 益气化瘀中药 大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of Yiqi Huayu Recipe on the expression of protein kinase C (PKC) and CyclinE in rats with gastric precancerous lesions (GPL). Methods The model of GPL was established mainly through N-methyl-N-nitro N-nitrosoguanidine (MNNG) together with other factors including alcohol stimulation and undue hunger and overeating. The survived rats after modeling were randomly pided into spontaneous recovery， and high-， moderate- and low-dose Yiqi Huayu group. After the corresponding treatment， the expression of PKC and CyclinE were detected by immunohistochemical method in each group. Results The expression of PKC and CyclinE in trement group were distinctly lower than those in spontaneous recovery group (P&<0.05). Conclusion Yiqi Huayu Recipe was effective in the treatment of rats with GPL by inhibiting the expression of PKC and CyclinE.
Key words：gastric precancerous lesions；protein kinase C；CyclinE；Yiqi Huayu Recipe；rat
慢性萎缩性胃炎(CAG)伴中重度不典型增生或/和不完全性结肠型化生是胃癌的重要癌前病变。益气化瘀法是临床治疗胃癌前病变的主要治疗方法，取得了很好的治疗效果。为了探讨其作用机制，特设计本实验，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要药物、试剂及仪器
甲硝基亚硝基胍(MNNG)为Fluka公司产品，每周用双蒸水配成1 g/L的母液，4 ℃避光储存，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产；蛋白激酶C(PKC)小鼠抗大鼠单克隆抗体为Santa Gruz公司产品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶标记链亲合素(三抗)、DAB、封闭用山羊血清等为博士德试剂公司产品；细胞周期素E (CyclinE)单克隆抗体购于福州迈新生物技术开发公司。益气化瘀中药主要由太子参、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等组成，浓度2 g/mL。
1.2 造模及给药
选用SPF级6周龄SD雄性大鼠62只，体质量100～120 g。造模参照严氏等[1-3]综合造模方法并加以改进。大鼠自购进后适应性喂养1 d。从62只大鼠中随机抽取13只作为正常组，其余49只用于造模。正常组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用100 mg/L MNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.3 g/L雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56 ℃ 150 g/L的氯化钠液按10 mL/kg灌胃，进食2 d，禁食l d，进食当天下午用8.5 g/L脱氧胆酸钠溶液按l0 mL/kg灌胃，禁食当天下午用400 mL/L乙醇按l0 mL/kg灌胃，连续24周。24周末时随机抽取正常组和造模大鼠各1只，杀检，观察组织病理学变化(以HE染色光学显微镜下观察的结果为主)，确认模型是否成功。
造模型成功后，将造模存活的48只大鼠随机分为自然恢复组l2只，中药高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组)各12只。高剂量组每日每只按20 g/kg(相当于成人1 d用量的2倍)灌胃，中剂量组按10 g/kg(相当于成人1 d用量)灌胃，低剂量组按5 g/kg(相当于成人1 d用量的一半)灌胃。治疗16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1 d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片5 mm，免疫组织化学染色。
1.3 检测方法及判断标准
免疫组织化学用SP法，按试剂说明书操作，DAB显色，PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。CyclinE定位于细胞核，免疫组化染色阳性信号为棕色和棕黄色；PKC主要存在于胞浆，免疫组化染色阳性信号为黄色。
CyclinE每张切片随机选取4个400高倍视野。“-”：无阳性细胞或阳性细胞数&<5%；“+”：阳性细胞数5%～20%；“++”：阳性细胞数20%～60%；“+++”：阳性细胞数≥60%。PKC每张切片随机取染色区域4个高倍视野阳性细胞平均数，用半定量计分[4]。染色强度用0～3级计分：0为无染色；1为轻度阳性染色；2为中度阳性染色；3为强阳性染色。染色范围根据细胞阳性染色的百分数分为0～4级：0为无染色；1为5%～10%细胞染色；2为10%～20%细胞染色；3为20%～50%细胞染色；4为&>50%细胞染色。染色总评分为染色强度＋染色范围。
1.4 统计学方法
计数资料用卡方检验，计量资料用t检验，数据用x±s表示， P&<0.05认为有显著性意义。
2 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠PKC蛋白表达情况(略)注：与自然恢复组比较，*P&<0.05；与正常组比较，#P&<0.01；自然恢复组死亡2只，不纳入统计(下同)表2 各组大鼠CyclinE蛋白表达情况(略)
3 讨论
PKC是1977年由日本学者Nishi zuka等首次在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，其广泛分布于真核细胞中，由多种具有不同生物学特性的同工酶组成，是细胞内信号传导的重要递质。PKC通常处于失活状态，被激活后可由细胞质转位到细胞膜，能够使众多蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化而发挥作用。因此，PKC的活化不仅与正常细胞和异常细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学效应有关，更在肿瘤的发生、发展、转移和多药耐药等方面发挥重要作用。有人采用不同浓度的PKC抑制剂Staurosporine(ST)作用于人胃癌细胞株MGC 803和SGC 7901后，细胞增殖受到明显抑制，表明PKC在胃癌细胞增殖中具有重要作用[5]。胃癌细胞增殖时，PKC活性表现为上调趋势，而诱导胃癌细胞凋亡时，它表现为下调趋势[5-7]，一些化疗药物和抑制增殖及诱导凋亡的药物如特异性环氧化酶2抑制剂也通过下调PKC活性而抑制胃癌细胞生长[8-9]。CyclinE是细胞周期G1/S期转移调控的一个正性调控因子，在细胞周期中含量是呈周期性变化的细胞周期调控蛋白[10]。异常情况下CyclinE蛋白失去周期性表达，而在整个细胞周期中表达水平高，则可使细胞发生异常增殖[11]，从而参与肿瘤的发生发展。
本实验结果表明，以MNNG为主的多因素联合攻击法诱发的大鼠胃癌前病变(自然恢复组)黏膜PKC、CyclinE蛋白表达明显增高，益气化瘀中药治疗组能使PKC蛋白表达及CyclinE蛋白阳性例(率)明显下降，与自然恢复组比较，P&<0.05。说明益气化瘀中药可能是通过下调PKC及CyclinE的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。
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