作者：李敏芳 李慧 王学美 王国华
【摘要】 ：目的 建立高效液相色谱法测定加味五子衍宗丸中淫羊藿苷含量的方法。方法 采用Lichrospher C18色谱柱，乙腈-水(30∶70)为流动相，流速为1.0 mL/min，，检测波长270 nm，柱温为30 ℃。结果 淫羊藿苷在0.208～2.600 μg范围与峰面积呈良好线性关系(r＝0.999 9)，平均回收率100.86%，RSD＝0.71%(n＝6)。结论 该方法简便，准确，重现性好，可用于加味五子衍宗丸的质量控制。
【关键词】 加味五子衍宗丸 淫羊藿苷 高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish the method of content determination of icariin in Jiawei Wuzi Yanzong Pill. Method The HPLC method was used to determine the content of icariin from Jiawei Wuzi Yanzong Pill. The analysis was carried out on Lichrospher C18 column (250 mm×4.6 mm， 5 μm) with acetonitrile-water (30∶70) as mobile phase， flow-rate of 1.0 mL/min and wave-length at 270 nm at 30 ℃. Results The liner range of icariin was 0.28～2.60 μg with a correlation(r) of 0.999 9. The recovery was 100.86% with RSD of 0.71%. Conclusion The method had good reproducibility and sensitivity to determine the content of icariin from Jiawei Wuzi Yanzong Pill.
Key words：Jiawei Wuzi Yanzong Pill；icariin；HPLC
加味五子衍宗丸是由淫羊藿、枸杞子、菟丝子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、车前子(盐炒)加工制成的水蜜丸，具有填精补髓、疏补肾气的功效。现代药理研究表明，该方对中枢神经系统具有保护作用，能改善轻度认知障碍(MCI)患者的记忆功能[1]；能够通过改变脑乙酰胆碱含量及乙酰胆碱酯酶活性，从而提高中枢胆碱能系统功能，对东莨菪碱所引起的小鼠学习记忆障碍具有保护作用[2]。本试验以淫羊藿苷为指标成分，建立了加味五子衍宗丸中淫羊藿苷的高效液相色谱测定方法。
1 仪器、药品与试剂
高效液相色谱仪，Waters 717自动进样器，1515泵，2487检测器(美国Waters公司)；Empower色谱工作站；0.45 μm微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)；KQ-100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110737-200413)；加味五子衍宗丸由永安堂提供(批号3050801，3050802，3050803)。乙腈为色谱纯，水为高纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Lichrospher C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，)，流动相为乙腈-水(30∶70)，流速1.0 mL/min，检测波长270 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL，分析时间6 min。在该色谱条件下，淫羊藿苷的保留时间为4.8 min，对照品、样品及阴性的色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取淫羊藿苷对照品10.40 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液(1.040 mg/mL)，备用。精确量取上述对照品储备液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(0.104 0 mg/mL)。
2.3 供试品溶液制备
精密称取加味五子衍宗丸细粉(过40目筛)约0.25 g，置25 mL容量瓶中，加入50%稀乙醇20 mL，超声处理60 min，放冷，加50%稀乙醇至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察
取上述淫羊藿苷对照品溶液，以2、6、8、12、15、25 μL分别进样，按上述色谱条件测定淫羊藿苷峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程Y＝988 490X－10 991，r＝0.999 9，在0.208～2.600 μg时与峰面积呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
取对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL，测定其峰面积，RSD＝0.84%，实验结果表明，该方法有良好的精密度。
2.6 稳定性试验
取供试品溶液，在0、1、2、4、6、8 h分别进样20 μL，记录峰面积，结果峰面积的RSD＝1.23%，表明供试品溶液至少在8 h内稳定。
2.7 重复性试验
分别称取0.25 g同一批药材，按供试品溶液制备方法制备6份，按上述色谱条件分别各进样20 μL，测定淫羊藿苷峰面积，结果淫羊藿苷平均含量为0.24%，RSD＝1.70%，该分析方法有良好的重复性。
2.8 回收率试验
精密称取已知含量的加味五子衍宗丸粉末0.25 g，6份，分别精密加入淫羊藿苷对照品储备液(1.040 mg/mL)620 μL，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件进行测定，计算回收率(见表1)，结果淫羊藿苷平均回收率为101.4%，RSD＝1.56%。表1 淫羊藿苷加样回收率试验结果（略）
2.9 样品测定
精密称取本品3批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进行测定，并计算含量，淫羊藿苷含量测定结果见表2。表2 加味五子衍宗丸中淫羊藿苷含量（略）
3 讨论
淫羊藿苷可溶于甲醇、乙醇等溶剂，采用甲醇、乙醇和50%稀乙醇超声提取60 min，结果表明，50%稀乙醇超声提取效果较好；并且对超声提取时间20、40、60、120 min进行了考察，表明超声提取60 min较好。
本实验建立了高效液相色谱法测定加味五子衍宗丸中淫羊藿苷含量的方法，该测定方法简单、稳定，重复性好，杂质干扰小，可作为加味五子衍宗丸的质量控制方法。
【参考文献
】
[1] 王学美，富 宏，刘庚信，等.加味五子衍宗颗粒治疗轻度认知障碍的临床研究[J].中国西医结合">中西医结合杂志，2004，24(5)：393－395.
[2] 褚松龄，王学美，富 宏.加味五子衍宗方及有效组分对记忆障碍小鼠中枢胆碱能系统的影响[J].中国中医药信息杂志，2006，13(2)：18－19.