作者：陈小军 顾立刚 石太平 孙建宁
【摘要】 ：目的 观察异亚丙基莽草酸(ISA)对人宫颈癌Hela细胞转录因子STAT1、STAT3、NF-κB表达作用的影响，探讨其抗炎作用机制。方法 用MTT法体外检测ISA不同浓度对Hela细胞生长的抑制作用，采用双荧光素酶报告系统检测不同浓度药物对转录因子STAT1、STAT3、NF-κB表达活性的影响。结果 ISA对人宫颈癌Hela细胞的生长没有明显的抑制作用；ISA处理组NF-κB-luc荧光素酶活性下降，而GAS-luc、STAT3-luc荧光素酶活性无明显改变。结论 ISA可能通过下调转录因子NF-κB的活性，抑制炎症因子的表达，对炎症反应起到抑制作用。
【关键词】 异亚丙基莽草酸 NF-κB 抗炎 Hela细胞
Abstract：Objective To study the effect of 3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid (ISA) on transcription factor STAT1， STAT3 and NF-κB in human cervix cancer Hela cell. Methods The cell proliferation was assessed by MTT assay. The luciferase activity of transcription factor STAT1， STAT3 and NF-κB was determined by the Dual-Luciferase Reporter Assay System. Results ISA can not inhibited the growth of Hela cell. The luciferase activity of transcription factor NF-κB in Hela cells treated with ISA was inhibited， while the luciferase activities of transcription factor STAT1 and STAT3 were not inhibited. Conclusion ISA can inhibit inflammation， which may be related with suppression of NF-κB transcriptional activity.
Key words：3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid；NF-κB；anti-inflammation；Hela cell
异亚丙基莽草酸(3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid，ISA)是木兰科植物八角茴香中提取的有效成分莽草酸的衍生物。ISA极性小且水溶性较好，结构稳定，很利于药学研究。目前试验证明，ISA有一定的抗炎作用，如对局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的抑制作用[1-2]，但其内在机制尚不清楚。
已知，转录因子STAT1、STAT3和NF-κB在炎症发生发展过程中起着重要的调控作用[3-4]。目前研究证实，在感染和炎症条件下，炎症性细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α等可以通过STAT1、STAT3 和NF-κB通路活化，诱导趋化因子、粘附分子等炎性介质的表达，介导炎症反应[5-6]。为此，本研究应用ISA处理人宫颈癌Hela细胞，体外观察对细胞转录因子STAT1、STAT3和NF-κB转录活性的影响，探讨ISA是否通过下调转录因子NF-κB的活性，抑制炎症因子的表达，对炎症反应起到抑制作用，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
ISA，纯度&>98%，无色片状结晶，北京中医药大学药理教研室孙建宁教授提供。人宫颈癌Hela细胞株，国家人类基因组北方研究中心功能基因组Ш细胞库提供。胎牛血清、DMEM均为Hyclone产品。MTT、双荧光素酶试剂盒和报告基因GAS-luc、STAT3-luc、NF-κB-luc均为Promega产品。高效真核转染试剂盒为威格拉斯仪器有限公司产品。
1.2 细胞培养
将人宫颈癌Hela细胞以含10%胎牛血清的DMEM在37 ℃、5% CO2孵箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 细胞增殖抑制实验
取对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板(细胞数为2×104/孔，100 μL/孔)，加入不同浓度的ISA[7]，使其终浓度分别为0、0.1、1、10、100 μmol/L，37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h后每孔加入MTT溶液15 μL，继续培养4 h后每孔加入裂解终止液100 μL，37 ℃、5% CO2孵箱中培养1 h，酶联检测仪570 nm波长处测定吸收度A值。
1.4 质粒转染
人宫颈癌Hela细胞以1×104/孔接种于96孔培养板，24 h后根据高效真核转染试剂盒说明书进行转染。将报告基因质粒GAS-luc、STAT3-luc、NF-κB-luc分别和内参质粒pRL-TK共转染入上述细胞培养孔中，三复孔，重复3次。
1.5 双荧光素酶活性测定
6 h后加入0.1、1、10、100 μmol/L浓度的ISA，37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h后，分别加入不同的刺激剂(对STATs筛选通路用100 ng/mL IFN-γ或100 U/mL的IL-6刺激，NF-κB通路用1 ng/μL TNF-α刺激)，于37 ℃孵箱中继续培养6 h后，收集细胞，加入1×PLB裂解液处理细胞后，用双荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。
1.6 统计学方法
定量数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析。
2 结果
2.1 异亚丙基莽草酸对Hela细胞增殖的影响
ISA 0.1～100 μmol/L不同剂量作用48 h对Hela细胞体外增殖没有明显的抑制作用(见表1)。表1 ISA对Hela细胞增殖的抑制作用(略)
2.2 异亚丙基莽草酸对Hela细胞STAT1、STAT3、NF-κB荧光素酶活性的影响
不同浓度的ISA处理24 h后，通过双荧光素酶报告系统检测发现，与对照组比较，处理组GAS-luc、STAT3-luc活性无明显改变，而NF-κB-luc荧光素酶活性受到抑制，其中0.1～10 μmol/L的ISA在TNF-α刺激状态下抑制作用更明显(见图1～图3)。
3 讨论
ISA是木兰科植物八角茴香中提取的有效成分莽草酸的活性衍生物之一。目前实验证明，ISA有一定的抗炎作用，其抗炎作用与抑制PGE2合成即脂质过氧化有关；对局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的抑制作用，可明显降低脑组织匀浆MPO活性以及IL-1、TNF-α的水平[1-2]，但其内在机制尚不清楚。本实验在以往报道基础上，以人宫颈癌Hela细胞为模型，采用MTT法，结果发现，ISA 0.1～100 μmol/L不同浓度作用48 h对Hela细胞体外增殖没有明显的抑制作用，初步推断对细胞生长、增殖和凋亡没有明显的作用。
转录因子STAT1、STAT3和NF-κB在炎症发生发展过程中起着重要的调控作用[3-4]。转录因子STAT1和STAT3属于STAT (signal transducers and activators of transcription)转录因子家族成员，通常以无活性形式存在于胞浆中。它们在多种炎性细胞因子、生长因子等信号转导过程中被激活，参与细胞分化、增殖、凋亡和炎症反应等生理病理过程[5-6]。其中，GAS-luc荧光素酶报告基因用于监测所有STAT蛋白活化，启动子区包括2个重复的GAS(gamma-interferon activation site)元件，源序列来自STAT1/3的靶基因ICAM-1启动子[8]，是所有STAT蛋白识别共同序列，它可被所有STAT蛋白识别。STAT3-luc荧光素酶报告基因用于特异性监测STAT3蛋白活性变化，基本不被其它STAT蛋白识别。在感染和炎症条件下，炎症性细胞因子IL-6、IFN-γ等外界刺激经一系列JAK-STAT信号通路磷酸化STAT1和STAT3，形成STAT1和STAT3同源或异源二聚体，从而增强其DNA结合活性，激活转录活性，上调生长分化、增殖、凋亡和炎症反应等相关基因。NF-κB是一种核转录因子，其信号传导途径在免疫应答、细胞生长控制和抑制凋亡等一系列生理生化过程中，以及炎性疾病、癌症等一系列病理过程中起着关键作用。在感染和炎症条件下，细胞外信号(如：炎性细胞因子IL-6、TNF-α，缺血性应激NO、氧自由基等)通过细胞膜特异性受体将信号传导至IKK蛋白(由α、β、γ 3个不同的亚基构成)，IKK蛋白将I-κB磷酸化，后者随即泛素化，并为泛素依赖的蛋白酶体降解，释放出有活性的NF-κB(为NF-κB家族蛋白组成的异二聚体，常见为p65和p50)，同时暴露出NLS序列，入核参与转录调控粘附分子、细胞因子、趋化因子等炎症介质[9]。因而已成为炎症基因治疗中的一个新靶点。所以，探讨其相关调控机制，将有助于炎症性疾病的基因治疗。
为了进一步了解ISA的抗炎机制，本研究采用双荧光素酶报告系统方法进行研究，结果发现，人宫颈癌Hela细胞经不同浓度的ISA处理24 h后，与对照组比较，GAS-luc、STAT3-luc活性无明显改变，而NF-κB-luc荧光素酶活性受到抑制，其中0.1～10 μmol/L的ISA在TNF-α刺激状态下抑制作用更明显。由此提示，ISA抑制炎症反应的机制之一是下调了转录因子NF-κB的活性。
参考文献
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