作者：李莲花，李淑菊，王今朝，于卓，张佩青
【摘要】 目的 观察肾衰胶囊改善肾间质纤维化的作用。方法 采用腺嘌呤混悬液制作大鼠肾功能衰竭模型，通过中药肾衰胶囊治疗，观测血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、转化生长因子(TGF-β1)及病理改变。结果 肾衰胶囊组与尿毒清组比较，能显著降低SCr、BUN(P&<0.05)，显著减少肾组织对TGF-β1的表达(P&<0.05)，改善肾脏纤维化程度。结论 肾衰胶囊对改善慢性肾功能衰竭大鼠肾间质纤维化有一定的治疗作用。
【关键词】 肾衰胶囊；慢性肾功能衰竭；肾间质纤维化；动物模型
慢性肾功能衰竭(CRF)是慢性肾脏疾病引起的肾功能损害，肾脏疾病进展到CRF的机制尚未完全阐明，但近年的研究显示肾间质病变与CRF进展关系密切，几乎所有肾脏疾病进展到肾功能衰竭终末期都会出现肾脏纤维化。
1 材料和方法
1.1 动物
选用雄性Wistar大鼠，体重200～240 g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。
1.2 药物及试剂
肾衰胶囊，0.5 g/粒，黑龙江省中医研究院制剂室生产并提供(批号：黑药制字[2004]Z第0010号)。尿毒清颗粒，5 g/袋，广州康臣药业有限公司生产(批号z10970122)。腺嘌呤，50 g/瓶，美国AMRESCO公司生产(批号0272B31)。兔抗大鼠TGF-β多克隆抗体，武汉博士德生物工程公司提供。山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，北京中山生物技术有限公司提供。
1.3 分组
取Wistar雄性大鼠60只，进入实验后适应性饲养1周，随机分为5组，每组12只。即正常组、模型组、尿毒清组、肾衰胶囊低剂量治疗组、肾衰胶囊高剂量治疗组。
1.4 造模及给药
除正常组外，其余组予2.5%腺嘌呤混悬液，按250 mg/(kg?d)灌胃，正常组给予等量蒸馏水，连续用药21 d，第22天眶底静脉丛取血0.5 mL，测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)，证实造模成功，造模过程中大鼠死亡8只。造模结束后开始治疗，大鼠给药剂量按每公斤体重占体表面积比值算得，肾衰胶囊低剂量组为临床等效组，按1.35g/(kg?d)灌胃，浓度为13.5%，高剂量组为其3倍，浓度为40.5%。尿毒清组按1.81 g/(kg?d)灌胃，浓度为20%。正常组、模型组给予2 mL蒸馏水灌胃。共治疗60 d，治疗过程中大鼠自由进食、水。治疗中模型组死亡2只，尿毒清组死亡1只。
1.5 实验取材
禁食水24 h，摘眼球取血5～6 mL，取血后脱颈椎处死大鼠，迅速腹部开口剖取双肾，纵向切开右肾，取一部分投入4%多聚甲醛固定24 h，切成厚度为2 mm的组织块，梯度酒精脱水，石蜡包埋、切片，脱蜡后进行HE染色及免疫组织化学检测。
1.6 统计学方法
采用SPSS11.5 for windows统计软件进行统计分析。结果用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验，等级资料用Ridit分析。
2 结果
2.1 实验大鼠造模后SCr、BUN比较
(见表1)表1 造模后各组大鼠SCr、BUN比较(略)注：与正常组比较，※P&<0.01。
2.2 用药后各组大鼠Scr、BUN比较
(见表2)表2 用药后各组SCr、BUN比较(略)注：与模型组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01；与尿毒清对照组比较，
○P&<0.05(下同)。
2.3 免疫组化
应用CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统进行半定量分析，高倍视野(200×)据染色面积和程度进行半定量分析。无阳性染色(-)，轻度阳性染色(+)，中度染色(++)，重度阳性染色(+++)，分别对结果赋分：1分(-)，2分(+)，3分(++)，4分(+++)。PBS代替一代作阴性对照，正常肾组织在髓质交界处的肾小管上皮细胞胞浆有少量表达，模型对照组大鼠TGF-β1表达遍布皮髓质处损伤肾小管上皮细胞胞浆，2，8二羟基腺嘌呤结晶周围增生的单核巨噬细胞也有表达，经治疗表达减弱，其中高剂量组表达最弱。结果见表3。表3 用药后各组大鼠TGF-β1表达比较(略)
2.4 肾脏组织HE染色观察
正常组中肾小管上皮细胞排列整齐，肾间质无纤维化组织增生，肾小管管腔无结晶物质沉积。模型组肾小管上皮细胞萎缩、变性、坏死、肾小管部分扩张，管腔内可见多数棕褐色结晶物质沉积，间质大量炎症细胞浸润，间质纤维组织成束状、成片状增生。尿毒清对照组与肾衰胶囊低剂量组中肾小管扩张，部分萎缩，间质有部分炎症细胞浸润，纤维组织中度增生，肾小管管腔可见较多的棕褐色结晶。肾衰胶囊高剂量组：肾小管上皮细胞轻度萎缩、变性，间质有极少量的炎症细胞散在分布，纤维组织增生不明显，个别管腔中有棕褐色结晶。
3 讨论
CRF是由于各种原因导致脾肾受损，二便失司，三焦气化失调，分清泌浊功能减退，秽浊溺污不得外泄，日久酿成浊毒，秽浊之邪蕴积于血而成瘀，肾络瘀阻，久则致瘀毒。所以脾肾两虚、浊毒内蕴、血络瘀阻为CRF病机演变的基本特征。肾衰胶囊中人参、熟地黄健脾补肾，益气养阴；大黄攻积导滞、清热解毒、活血化瘀；白术、茯苓健脾除湿；菟丝子、淫羊藿补肾填精养血；桃仁、红花、丹参、赤芍活血化瘀通络；豆蔻仁芳香化浊；黄连清热解毒祛湿；半夏、竹茹降逆止呕，诸药共奏补脾肾、解毒活血之功。
现代药理研究表明，大黄中的大黄素可明显抑制人肾成纤维细胞增殖、凋亡及通过C-myc蛋白高水平表达，诱导细胞凋亡，从而减轻肾间质纤维化改变[1]；丹参对肾成纤维细胞增殖有抑制作用，并通过使C-myc蛋白高水平表达，诱导细胞凋亡，减轻肾脏肾小管空泡变性及肾间质纤维化的病理改变，减低肾脏TGF-β1的表达[2]；桃仁能提高组织血容量，改善微循环和提高组织胶原酶活性，从而促进胶原分解代谢，减少组织内胶原含量，抑制肉芽形成，改善组织内纤维化[3]；淫羊藿可明显减轻大鼠7/8肾切除模型的肾脏组织学改变，减少细胞外基质的产生，抗肾间质纤维化[4]。
肾脏疾病进展到CRF的确切机制至今尚未完全阐明，但近年的研究显示肾间质病变与CRF进展关系更密切。肾间质纤维化是各种肾脏疾病发展至肾功能衰竭的共同途径。Eddy[5]根据其研究结果得出，纤维化是由于基质蛋白合成增加和基质降解受抑的综合结果，其中致纤维化的细胞因子TGF-β1表达上调在肾间质纤维化中起重要作用。TGF-β1参与肾间质纤维化的各个环节，活化的TGF-β1可产生许多与肾间质纤维化有关的反应，包括基质合成增加，抑制基质降解[6]，以及成纤维细胞和单核细胞的趋化。TGF-β1可能是外源性或内源性正常组织纤维化发生的主要细胞因子。
本实验中肾衰胶囊能显著降低肾衰模型大鼠SCr、BUN，显著减少肾组织对TGF-β1的表达，改善肾脏病理纤维化程度，从而得出，肾衰胶囊对改善慢性肾功能衰竭大鼠肾间质纤维化具有一定的治疗作用。
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