作者：李卫东，马树祥，邓春雷
【摘要】 目的 探讨电针对实验性痴呆幼龄大鼠脑组织一氧化氮(NO)的含量及对脑内神经性一氧化氮合酶(nNOS)表达的影响。方法 采用改良的Pusinelli-4VO(4-血管阻断法)，建立全脑缺血再灌注大鼠痴呆模型，随机分为假手术对照组、模型对照组、电针治疗组、脑复康治疗组，检测各组大鼠脑组织中NO含量变化及海马、皮质等处nNOS的表达变化，结合图像分析统计海马、皮质等处阳性细胞数，用Y型电迷宫进行行为学测试并定量测定学习记忆成绩。结果 模型组大鼠Y电迷宫成绩显著低于假手术组(P&<0.05)，其脑组织NO含量明显较假手术组为高(P&<0.05)，而海马CA1区nNOS蛋白表达和神经元丢失较假手术组为多(P&<0.05)。各治疗组Y电迷宫学习成绩优于模型组(P&<0.05)，而脑组织NO测值明显低于模型组，其海马CA1区NOS蛋白表达及神经元丢失较模型组明显减少(P&<0.05)，且与假手术组无显著性差异(P&>0.05)。结论 电针治疗可明显改善缺血性痴呆幼龄大鼠脑组织的抗氧化能力，抑制其脂质过氧化反应，减轻脑内活性氧损伤和自由基损伤反应，并抑制脑缺血后nNOS的过量增加和介导的细胞毒性作用，从而减少海马神经元的丢失，改善其学习记忆能力。
【关键词】 电针；痴呆；一氧化氮；神经性一氧化氮合酶；动物模型
Abstract：Objective To explore the effect of electroacupuncture on the level of nitric oxide (NO) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression in cerebral tissues of demention rats. Methods Vascular dementia (VD) rat model of reperfusion following cerebral global ischemia was established by using a modified Pulsinelli-4-vessel occlusion method. All the rats were randomly pided into 4 groups：sham-operated control group， model group， electroacupuncture group， Piracetan group. Histological survey was carried out to detect the contents of NO in cerebral tissues after treatment. nNos expression in CA1 areas of hippocampus and other cerebral areas was detected and calculated by Leica-bx60 Image Analyzer. Y-type maze was used to measure learning and memory scores of the rats. Results The scores of Y-type maze of the model group were apparently less than sham-operated group (P&<0.05)， the level of the NO increased compared with sham-operated group (P&<0.05). The levels of the NO decreased compared with model group (P&<0.05) in cerebral tissue after treatment. At the same time， the expression of nNOS of all treatment groups in CA1 area of hippocampus and other cerebral areas was reduced more than that of model group (P&<0.05). The scores of Y-maze of all treatment groups were higher than those of the model group (P&<0.05)， which were no difference from sham-operated (P&>0.05). Conclusions Electroacupuncture could apparently improve the ability of learning and memory of demention rats and the mechanism may be that electroacupuncture could improve antioxidative ability and inhibit active oxygen injury to relieve the cerebral tissues and the reaction of free radicals， and acupuncture could inhibit the over-increased nNOS after cerebral ischemia to protect the hippocampus neurons from decreasing.
Key words：electroacupuncture；demention；NO；neuronal nitric oxide synthase；animal model
现有研究表明，脑缺血损伤后学习记忆障碍可能多与中枢胆碱能系统、海马区缺血损伤、氧自由基、脂质过氧化物、单胺类递质、脑血流等改变有关[1]。笔者临床观察实验表明，电针对于治疗小儿智力低下(Mental Retardation，MR)有显著疗效。为了进一部探讨电针治疗MR的作用机理，本实验选取建立四血管阻断全脑缺血损伤后造成痴呆大鼠模型，采用五神针(百会穴前后左右旁开1.5寸)、三智针(神庭穴加双侧本神穴)进行针刺，并用Y电迷宫观测大鼠学习记忆，选取检测脑组织一氧化氮(NO)含量变化和用免疫组化法显示神经性一氧化氮合酶nNOS表达情况，以期探讨针刺与神经修复的相关性，反映提高智商的可行性，探索针刺促进神经功能修复，增强学习记忆的作用机理，为针刺防治MR疾病提供实验性依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级健康SD大鼠64只，雌雄各半，鼠龄40～60 d，体重(130±20)g，西安交通大学医学院医学实验动物中心提供。
1.2 药物
脑复康，济南利民制药有限公司生产， 批号20020706，用蒸馏水配成128 g/L混悬液，置4 ℃冰箱保存备用。
1.3 试剂
一抗NOSI 购自Santa cruz公司，批号0104725；SP试剂盒购自北京中山科技公司，批号0103047；NO试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，批号20020801；标准蛋白购自南京建成生物工程研究所，批号20020608。
2 实验方法
2.1 分组
64只大鼠适应性喂养1周后随机分为4组：假手术对照组(A组)、模型对照组(B组)、电针治疗组(C组)、脑复康治疗组(D组)，每组16只。
2.2 造模
参照文献[2]方法，采用改良的Pulsinelli-4VO(4-血管阻断法)，建立近似人类学习记忆障碍的血管性痴呆大鼠模型。用10%水合氯醛(0.05 mL/100 g体重)腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧固定于鼠台上，背侧项正中切口，分离出第一颈椎横突翼小孔，用电凝针凝闭双侧椎动脉，然后逐层缝合伤口，消毒，肌注青霉素80 U/次，每日2次，共肌注7 d；24 h后，将大鼠仰卧位固定于鼠台上，分离出双侧颈总动脉，可逆性夹闭双侧颈总动脉3次，每次5 min，间隔1 h后缝合伤口，消毒，肌注青霉素，剂量疗程同上。造模完后放回笼中常规饲养观察。假手术对照组：分离出双侧椎动脉，但不电凝，然后缝合伤口，消毒并肌注青霉；24 h后分离出双侧颈总动脉，但不夹闭，然后缝合伤口、消毒并肌注青霉素，剂量疗程同上。
2.3 处理方法
A组：治疗时，模拟捉拿，固定，擦拭酒精消毒，不施加针刺，但灌服生理盐水(每只2 mL/次)，每日1次，共28 d。B组：于造模后相同条件下正常饲养28 d，期间不施加针药影响和其他任何人为处理。C组：于造模后第10天行电针治疗，参考文献[3]方法并以比较解剖和骨度分寸法为依据，选取相当于人体的百会、四神聪、神庭、本神穴。针具用30号一寸毫针，针刺时于“百会”穴(顶骨正中)向前后左右方向各斜刺2 mm即相当于四神聪部位(相当于五神针)，最后固定于后神聪；“神庭”穴(百会穴向前9 mm左右)向上平刺，进针后向左右方向平刺6 mm即相当于双本神穴部位(相当于三智针)，最后固定于神庭向上平刺位，待大鼠出现嘶叫后接G-6805电针仪，采用连续波，频率80～100 Hz，刺激强度以头部出现轻微规律性抖动为准，15 min后出针。每次操作前均以酒精棉球消毒。治疗5 d，停2 d，连续4周，共治疗20次。D组：脑复康药物配成128 g/L溶液，造模后第10天起分别灌胃， 按0.4 g/kg，每次2 mL，每日1次，共治疗28 d。
2.4 观测指标及检测方法
2.4.1 STANS三等臂Y型电迷宫箱观测大鼠学习记忆成绩
分别于造模前、造模后第9天、治疗后用STANS三等臂Y型电迷宫箱观测各组大鼠学习记忆，Y型电迷宫箱臂长30 cm，高15 cm， 宽15 cm。每臂末端有15W信号灯示安全区，箱底铜栅间隔4 mm，电流强度0.7 A，选用电压38V，电击延时2 s。设一臂为起步区，按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂顺序轮流作为安全区。大鼠在起步区静置3 min，予以电击致其逃至安全区，灯光持续15 s，然后灯熄休息45 s，开始后一次操作。规定大鼠受电击后从起步区直接逃到安全区为“正确反应”。每日上、下午各测10次，期间休息1 min，连续计数，以10次中正确反应的次数表示学习记忆成绩。实验末次结束后，各组中均取出一半大鼠处死用来测生化指标，各组中剩余的大鼠用来做免疫组化。
2.4.2 NO的检测
用亚硝酸还原法测定脑组织NO的含量；指标检测按试剂盒说明操作。
转贴于2.4.3 免疫组化方法显示nNOS
大鼠经3%戊巴比妥 (40 mg/kg体重)腹腔注射麻醉后，待动物出现头项肢体软弱无力、反射均消失、但心跳呼吸仍存在，立即开胸暴露心脏，先在右心耳剪开一小口，再在心尖部剪开一小口，插入插管并夹子固定，快速生理盐水灌注， 灌注量为200 mL，至肝脏变白后再改灌注液为4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4，4)400 mL，进行快速灌注，灌注大约40 min左右迅速处死取脑，取出的脑组织放入25%蔗糖磷酸盐缓冲液中过夜，待组织下沉后作修切，作冠状连续冰冻切片，厚30 μm[4]，进行免疫组化染色[5]，nNOS工作浓度为1∶500。经DAB显色，阳性细胞呈棕黄色。用PBS代替一抗作为阴性对照，同时取每个脑组织相同部位的相邻切片进行光镜下观察，在光镜下选取皮层、海马CA1区、背侧脑室旁3个视野(10×20倍)，用Leica-bx60图像分析系统采点计数nNOS阳性细胞数，比较各组神经元丢失差异，同时摄像取彩图。
2.5 统计学方法
实验测定数据用x±s表示，组间两两比较采用方差分析(F检验)和q检验进行统计学处理分析。
3 结果
3.1 一般情况
造模后第1天，除假手术对照组外，实验动物出现饮食量减少，活动减少，反应迟钝，皮毛失去光泽，喜静，倦卧。24 h后待颈总动脉夹闭术后，动物出现翻正反射消失，呼吸存在，有的呼吸时伴喘鸣音，当天晚上有两只大鼠死亡。造模后第3天，陆续有两只大鼠死亡。造模1周后，动物体重明显下降，精神出现萎靡，毛发竖起，蓬松枯萎，活动减少，定向力差，饮食减少，步态不稳，行走时易跌倒，而假手术对照组未见异常变化，正常饮食，较活跃，造模10 d后开始针刺、西药治疗，治疗结束后，上述各种症状有明显改善，较假手术组无明显差距。
3.2 Y型电迷宫箱测大鼠学习记忆成绩
(见表1)表1 大鼠Y电迷宫测试成绩(略)注：与本组造模前比较，*P&<0.05；与A组比较，ΔP&<0.05；与B组比
较，#P&<0.05(下同)。
3.3 各组大鼠脑组织中NO含量、不同脑区nNOS阳性细胞变化
(见表2)表2 各组大鼠脑组织中NO含量、不同脑区nNOS阳性细胞
数统计(略)
3.4 形态学特征
nNOS免疫组化反应阳性细胞经DAB显色，可见胞浆内充满棕黄色阳性反应颗粒，胞核不着色。皮层的阳性细胞体积大，为圆形或椭圆形，可见到突起，其余部位的阳性细胞为小圆形，突起不着色。A组：各脑区的阳性反应细胞较少，染色较浅，且有较弱的神经元突起。B组：阳性细胞广泛分布于大脑皮层、杏仁核、下丘脑、背侧脑室旁、海马等，其中以皮层、海马CA1区、室周核居多。染色较深，突起多且长，有的交织成网。C组：各脑区的阳性细胞较少，仅见少量弱染色或中等染色的阳性细胞。多分散存在，海马CA1区少见，部分神经突起交织成网。D组：有阳性反应细胞存在，呈中等染色，阳性细胞多聚集在室周核，皮层有少量分散存在，有突起，并交织成网。海马CA1区少有。
4 讨论
MR是一种慢性疾病，指由于各种脑血管疾病引起的大脑功能障碍所产生的获得性智能缺损综合征。中医认为，先天之精气不足，脑海空虚，后天失养，心脾气血不足是导致本病的根本原因，多采用健脑补肾、补益心脾为大法进行治疗。
大鼠缺血再灌注损伤导致神经元损伤的原因包括缺氧和启动神经毒性级联反应，后者又涉及细胞死亡程序的激活，因此恢复血供和对神经毒性级联反应的控制减轻脑缺血后神经元损伤具有重要意义。产生神经毒因素很多，其中NOS起了很大作用。过度激活可产生过量NO，从而介导神经元的兴奋性毒性损伤，即NOS主要介导缺血神经元损伤，脑缺血缺氧时，由于EAA大量释放，激活NMDA、KA/AMPM及亲代谢受体，使细胞内Ca2+增加，后者和钙调蛋白结合，激活神经元NOS，使NO生成增加，介导EAA毒性作用，NO过量产生和释放，促进脑缺血缺氧程度。缺血缺氧时，脑内NO含量增加，NOS抑制剂可减少缺血损伤面积。脑组织缺血时，脑葡萄糖利用率降低，ATP生成减少，乳酸生成增多，脑组织中脂质过氧化物含量增多，生物膜变性和破坏增多，从而导致海马皮质等处神经元凋亡或死亡，进而导致智能状态下降。本实验结果提示，造模组大鼠Y电迷宫成绩显著低于假手术组，脑组织NO含量明显高于假手术组，海马CA1区nNOS蛋白表达和神经元丢失较假手术组为多；各治疗组Y电迷宫学习成绩优于模型组(P&<0.05)，脑组织NO明显低于模型组，海马CA1区nNOS蛋白表达及神经元丢失较模型组明显减少。说明“三智针”、“五神针”法对改善实验性痴呆幼龄大鼠学习记忆能力，降低脑组织NO含量，抑制nNOS过度表达明显优于或近似于西药组。其机理与电针改善缺血再灌注损伤引起的自由基损伤反应、脂质过氧化反应、神经毒作用有关，同时，可能在于电针刺激增加缺血损伤坏死边缘区的记忆突触即胆碱能突触的数目，使其密度增加，从而使残存的神经元发挥更大的作用，使记忆突触间隙变窄，得以加速突触间的传导功能，从而提高学习记忆功能。本实验证明电针对缺血缺氧性脑损伤后的疾病似有一定的保护和治疗作用。
【参考文献】
[1] 孟竞璧.电针对实验性脑梗塞过程中脑氧代谢的影响[J].针刺研究， 1986，21(3)：198.
[2] 贾健民，贾健平.大鼠脑反复缺血致不可逆性学习记忆障碍的研究[J].心理学报，1995，27(1)：69.
[3] 陈振虎，赖新生.电针对实验性血管性痴呆大鼠学习和记忆功能的影响[J].针刺研究，2000，25(4)：245.
[4] 谢兴国，蔡文登.一氧化氮合酶阳性神经元在小鼠脑内的分布[J].解剖学杂志，2002， 25(1)：47－48.
[5] 张雪朝，肖茂磊.耳针改善血管性痴呆大鼠记忆与NOS 表达的关系[J].上海针灸杂志，2001，20(1)：40.