作者：段水竹，霍亚平，关坤萍，田峰，张剑宇，张永洛
【摘要】 目的 观察复方补肾中药对去卵巢大鼠骨质疏松的作用并从分子学水平探讨其作用机制。方法 通过切除大鼠双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症模型。去卵巢术后1周，用灌胃法给服益坤精胶囊10周，以尼尔雌醇和生理盐水作为对照，观察各组大鼠骨密度及骨形态学的改变，并以RIA法检测各组大鼠骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。结果 中药组骨密度显著高于去卵巢组(P&<0.01)，骨形态学亦显著改善。而骨组织中IL-1β、IL-6及TNF-α含量均显著低于去卵巢组(P&<0.05)。结论 补肾中药能较好地预防去卵巢所致大鼠的骨质疏松，其作用机制可能是其能有效地降低去卵巢大鼠骨组织微环境中细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量而减少骨丢失。
【关键词】 骨质疏松；白细胞介素-1；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α；动物模型；补肾中药
Abstract：Objective To observe the influence of kidney invigoration drug on of osteoporosis ovariectomy rats and study its mechanism. Methods Adult ovariectomized rats were used in this study as the model of postmenopausal osteoporosis. After being fed with the drug of kidney invigoration for 10 weeks， the general BMD of rats， the level of IL-1β， IL-6 and TNF-α in bone were tested. And the histological changes of bone were observed. Results Compared with the model， the general BMD in treated groups increased significantly (P&<0.01) while the level of IL-1β， IL-6 and TNF-α in bone decreased significantly (P&<0.05). The level of IL-1β， IL-6 and TNF-α in bone of ovariectomized rats were increased significantly. Conclusions The drug of kidney invigoration can prevent from female rats osteoporosis induced by ovariectomy. One of the mechanisms was that it can inhibit the level of IL-1β， IL-6 and TNF-α in bone and decrease bone lose.
Key words：osteoporosis；postmenopausal；IL-1；IL-6；TNF-α；animal model；drug of kidney invigoration
绝经后骨质疏松症(PMOP)是由雌激素减少所致的骨质疏松，随着细胞生物学和分子生物学研究的不断深入，骨髓微环境中细胞因子的作用越来越受到人们的重视。为进一步探讨补肾中药防治骨质疏松的作用机理，本研究通过切除大鼠卵巢建立骨质疏松动物模型，观察复方补肾中药对去卵巢大鼠骨质疏松的作用，并通过其对骨组织中白细胞介素(IL)IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-6的影响探讨补肾中药的作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
三月龄SD雌鼠50只，体重200～220 g， 山西医科大学动物实验中心提供。
1.2 药物
益坤精胶囊主要由菟丝子、巴戟天、肉苁蓉、枸杞子、生地黄、当归等药组成，山西医科大学第二临床医学院制剂室提供，每粒剂量0.3 g；尼尔雌醇，北京四环制药厂生产，每片1 mg，批号20010801。
1.3 试剂
血清雌二醇(E2)放射免疫分析测定盒由中国原子能科学研究院同位素研究所提供。IL-1、IL-6和TNF-α放射免疫分析测定盒由中国人民解放军总医院科技开发中心放免所提供。 Hank's液、1640液、Schcidde液均根据文献配制。
1.4 仪器
双能X线吸收测量仪(美国Lunar公司生产)、CO2培养箱RCO3000TVB、离心机LD-24-0.8型、γ-计数器GAMMA-C12型。
2 实验方法
2.1 动物分组及造模
3月龄SD 雌性大鼠50只，随机分为5组，每组10只，即假手术组、去卵巢组、尼尔雌醇组、中药高剂量组、中药低剂量组。分组后，假手术组在无菌条件下，以40 mg/kg体重的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，俯位固定，经腰椎旁切口进入大鼠腹腔背侧，将卵巢提出腹腔，再送回关腹。其余各组均在相同条件下切除双侧卵巢，然后止血缝合。术后1周行阴道涂片，确定无动情周期变化者为造模成功。
2.2 动物给药及喂养
造模成功后，中药高剂量组以益坤精胶囊1.44 g/kg 体重灌胃，中药低剂量组以益坤精胶囊0.72 g/kg体重灌胃，每日1次；尼尔雌醇组0.25 mg/kg 体重灌胃，每两周1次，用药间歇期每天灌以等体积的生理盐水；假手术组、去卵巢组每天灌以等体积的生理盐水。给药时间为10周。各组大鼠于室温下分笼饲养，自由摄取标准饲料，自由饮用蒸馏水。
转贴于2.3 检测项目
2.3.1骨密度测定
将大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，四肢展开平置于双能X线吸收测量仪平台上，测定大鼠全身的骨密度。
2.3.2 雌激素测定
处死前内眦静脉采血，离心后提取血清，-20 ℃保存待测。采用放射免疫法(RIA)检测血清E2水平。
2.3.3 组织形态学观察
大鼠股骨干骺端，以10%甲醛常规固定，Schcidde液脱钙处理后石蜡制片。HE染色，光镜下观察。
2.3.4 骨组织培养及IL-1、IL-6和TNF-α测定
无菌条件下取大鼠右侧股骨及胫骨，Hank's液反复冲洗，用骨钳将其分离为1 mm3碎块，称量2 g，置于3 mL含5%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，常规条件下(37 ℃、100%湿度、φ=5% CO2培养箱中)培养48 h，吸取培养液，离心后取上清液，RIA法检测IL-1、IL-6和TNF-α的含量。
2.4 统计学方法
所有指标均以—x±s表示，统计分析采用SPSS10.0软件进行多均值单因方差分析，用LSD法进行两两比较。
3 结果
3.1 各组大鼠骨密度、血清雌二醇含量
(见表1)表1 各组大鼠骨密度及血清雌二醇含量比较(略)注：与去卵巢组比较， *P&<0.01，** P&<0.05； 与假手术组比较，ΔP&<0.01
ΔΔP&<0.05。
3.2 骨组织中IL-1、IL-6和TNF-α含量的变化
(见表2)表2 各组大鼠骨密度及骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α
含量的比较(略)
3.3 骨组织形态学观察
去卵巢组股骨干骺端骨小梁明显变稀疏、断裂，皮质骨变薄，骨髓腔相对扩大，部分区域骨小梁消失。对照组及治疗组股骨干骺端骨小梁丰富，皮质骨致密，小梁排列以纵向为主。在皮质骨形成表面，治疗组均可见成对状排列、似上皮细胞样覆盖于新生骨表面的成骨细胞。
4 讨论
本实验结束时，与假手术组比较，去卵巢组大鼠骨密度明显降低，股骨干骺端骨小梁明显稀疏、断裂，表明大鼠骨质疏松模型建立成功。用药10周后，中药高、低剂量组骨密度明显增加，骨小梁较丰富，显示补肾中药益坤精胶囊对去卵巢所致的骨质疏松具有良好的防治作用。
近年来研究表明，一些局部调节因子尤其是骨髓微环境中的细胞因子在绝经后骨质疏松症的发病过程中起重要作用。其中IL-1和TNF是已知的最有效的骨吸收刺激因子。IL-1和TNF主要来源于单核-巨噬细胞系的单核细胞，它们能作用于骨基质细胞使其分泌IL-6[1]。可使早期破骨细胞前体转化为无活性的晚期破骨细胞前体，后者在成骨细胞作用下转变为有活性的成熟破骨细胞[2]。雌激素不仅抑制单核细胞产生IL-1和TNF，而且还抑制骨基质细胞分泌上述细胞因子，并降低基质细胞对IL-1和TNF的敏感性。另一个倍受关注的细胞因子是IL-6。IL-6存在于骨基质中，在甲状旁腺素(PTH)和其他细胞因子(如IL-1和TNF)作用下，由成骨细胞、破骨细胞和基质细胞产生。研究证实，IL-6可增加破骨细胞形成，刺激骨吸收。IL-6主要作用于破骨细胞的早期阶段，刺激早期的破骨细胞前体分裂增殖[3]。IL-6还刺激正常成熟的破骨细胞形成骨吸收陷窝[4]。此外，IL-6通过胶原酶的释放而加强骨基质降解。且IL-6能和其他的细胞因子、激素产生协同作用，共同调节破骨细胞的形成，使骨吸收作用大大增强[5]。
本实验结束时，与假手术组相比，去卵巢组大鼠骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明显增高，提示雌激素对骨髓微环境中的细胞因子具有抑制作用。雌激素缺乏时，大量细胞因子进入骨的微环境，使骨吸收增强而致骨质疏松。益坤精胶囊抑制了上述细胞因子的分泌，减轻了由于骨吸收增加而引起的骨量和骨微结构的变化。表明补肾中药对去卵巢所致大鼠的骨质疏松确有良好的防治作用，其抗骨质疏松的作用部分是通过抑制骨髓微环境中IL-1β、IL-6和TNF-α产生而介导的。
【参考文献
】
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