【关键词】 厚朴酚；和厚朴酚；肿瘤；综述
厚朴酚(magnolol，MG)与和厚朴酚(honokiol，HK)是我国传统中药厚朴的两个主要活性成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、肌肉松弛、降胆固醇和抗衰老等广泛的药理作用。笔者就MG与HK的抗肿瘤作用和作用机制的研究进展综述如下。
1 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡是在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞自杀现象。选择性诱导细胞凋亡已成为治疗恶性肿瘤的基本策略。许多实验发现：MG和HK有诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用。如：MG能诱导人鳞状细胞肺癌Ch37细胞[1]、人HL-60细胞和白血病Jurkat T细胞[2]、黑色素瘤B16-BL6细胞、人结肠癌COLO-205和人肝细胞癌Hep-G2细胞[3]以及人宫颈癌HeLa细胞[4]的凋亡，作用呈时间和剂量依赖性，而并不诱导中性粒细胞和外周血单核细胞的凋亡[2]，对人正常胚肺HEL299细胞的细胞毒作用弱于HeLa细胞[4]。HK能诱导人淋巴样白血病Molt 4B细胞株[5]、Ch37细胞[6]、慢性B淋巴细胞性白血病(B-CLL)细胞[7]和人结直肠癌RKO细胞株[8]凋亡，作用呈剂量和时间依赖性，对B-CLL细胞的毒性大于正常的单核细胞[7]。
caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶，能特异性裂解天冬氨酸后的蛋白残基，在细胞凋亡的信号传导中起重要作用。迄今为止已发现14种caspase，其中7种和凋亡有关，分为两类：一类是上游或启动caspase(包括caspase-2，-8，-9，-10)；一类是下游或效应caspase(包括caspase-3，-6，-7)。在体外增殖实验中，100 mmol/L MG 24 h能诱导B16-BL6、THP-1和HT-1080细胞凋亡(但对BAE细胞株无效)，继而上调caspase-3和caspase-8活性[9]。100 mmol/L MG上调caspase活性的作用可被caspase家族抑制剂z-VAD-fmk所抑制。提示MG肿瘤生长是通过激活caspase而诱导细胞凋亡起作用的。在MG诱导人HL-60细胞和白血病Jurkat T细胞凋亡的实验中发现，caspase-9、caspase-3和caspase-2被激活及聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白分解性剪切。PARP，即poly(ADP-ribose) polymerase，在体外可以被多种caspase剪切，在体内是caspase-3的主要剪切对象。被剪切后的PARP失去其酶活力。PARP对于细胞的稳定和存活非常重要，PARP失去酶活力会加速细胞的不稳定。PARP剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是caspase-3激活的指标。caspase家族抑制剂和caspase-9选择性抑制剂能阻止MG诱导的细胞凋亡，caspase-3和caspase-2抑制剂能部分抑制凋亡[2]。在 MG诱导人鳞状细胞肺癌Ch37细胞凋亡实验中，MG能导致caspase-9、caspase-3和caspase-6的激活。用z-VAD-fmk预处理可显著抑制MG诱导的细胞凋亡[1]。caspase-3，-8，-9，-10抑制剂及caspase家族抑制剂可明显抑制MG诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡。80 μmol/L MG作用于HeLa细胞12 h后caspase-3前体被降解，即产生活化的caspase-3；同时， caspase-3底物ICAD(inhibitor of caspase dependent DNase)和PARP被剪切，进一步表明MG诱导的HeLa细胞凋亡时激活了caspase-3。caspase-3位于caspase级联反应的下游，是细胞死亡的执行者。caspase-8和-10的抑制剂对HeLa细胞凋亡的抑制作用表明死亡受体途径有可能参与这一过程[4]。在慢性B淋巴细胞性白血病患者原代培养细胞中，HK诱导的凋亡特征是caspase-3，-8和-9活化以及PARP剪切[7]。在HK处理的Ch37细胞中还发现：caspase-3蛋白水解性活化和PARP剪切。caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk和caspase家族抑制剂z-VAD-fmk显著阻断HK诱导的凋亡[6]。
以上这些结果证明：激活caspase是MG和HK诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一。在人多发性骨髓瘤(MM)细胞株和复发的难治性MM患者的肿瘤细胞中[10]，虽然HK触发caspase-3，-7，-8，-9的活化，但caspase家族抑制剂z-VAD-fmk并不能阻断HK诱导的细胞凋亡。HK可诱导线粒体释放凋亡诱导因子(AIF，一种非caspase依赖性凋亡实施者)。而且在HK诱导凋亡的SU-DHL4细胞株中，caspase-3和-8水平很低，提示HK除了caspase途径外还有和非caspase依赖性途径参与了HK诱导细胞凋亡的过程。
哺乳动物细胞凋亡主要有两条途径――死亡受体(death receptor，DR)途径和线粒体途径。死亡受体是肿瘤坏死因子受体超家族成员，其跨膜蛋白胞浆区内具有死亡结构域，当配体与死亡受体结合后，死亡结构域和适应蛋白结合，招募上游caspase，使上游caspase活化，从而进一步活化下游caspase，而下游caspase参与凋亡降解中的重要底物的剪切，引起细胞凋亡。在线粒体途径中，各种促凋亡信号促使细胞色素C自线粒体释放到胞浆，在ATP的参与下，胞浆细胞色素C结合并活化胞浆蛋白Apaf-1，从而导致caspase-9自身剪切和活化，活化后的上游caspase-9进一步活化下游caspase(主要是caspase-3)，使细胞凋亡。在MG诱导凋亡中发现，MG能降低线粒体跨膜电位，诱导细胞色素C释放入胞浆[2]。在人鳞状细胞肺癌Ch37细胞株中，MG能导致胞液内细胞色素C的积聚和caspase-9、caspase-3和caspase-6的激活[1]。用z-VAD-fmk预处理可显著抑制MG诱导的细胞凋亡，但并不阻止胞液内细胞色素C的累积。在MG诱导Hep-G2细胞凋亡[11]和HK诱导Ch37细胞凋亡[6]过程中也发现，线粒体细胞色素C参与了细胞凋亡过程。
Bcl-2家族是细胞凋亡中线粒体途径的调控者，主要包括两类成员：抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax、Bid和Bak等)。在多项研究中发现，MG和HK对这些蛋白水平有影响。在诱导HeLa细胞凋亡实验中，MG作用12 h后Bcl-XL减少，Bax的表达明显增加，Bax/Bcl-XL表达比率升高[4]。Bax的启动子区具有p53结合区。MG使HeLa细胞磷酸化p53和p53蛋白表达增加。在人鳞状细胞肺癌Ch37细胞株中[1]，80 mmol/L MG显著增加Bad和Bcl-XS蛋白质的表达，减少Bcl-XL的表达。Bcl-2高度表达能对抗MG诱导的Ch37细胞凋亡。在HK诱导RKO细胞凋亡中[12]，HK能上调mRNA的表达水平和Bid蛋白水平，并下调Bcl-XL，而对Bax和Bcl-2无影响，p53表达不变。
Lin SY等[11]对MG诱导Hep-G2细胞凋亡的研究发现：胞液内游离Ca2+增加，用磷脂酶c抑制剂U73122或细胞内Ca2+螯合物BAPTA/AM预处理，可抑制MG引起的细胞内Ca2+增加和激活caspase-8、caspase-9的作用，因此，这些细胞的凋亡发生率被大大减少。用ZB4(阻止Fas反应机制)预处理这些细胞，则MG诱导的caspase-8活化也减少，凋亡发生率减少。激动型Fas抗体CH-11对MG诱导的HeLa细胞死亡有协同作用，MG与CH-11共同作用HeLa细胞24 h后细胞死亡率显著高于MG或CH-11单独处理组。这些结果提示，细胞内Ca2+和Fas功能等细胞内信号参与了MG诱导的细胞凋亡[4]。
MG诱导了中等程度和持久的JNK活化和ERK灭活，而并不影响蛋白质水平。提示这些激酶也参与了凋亡过程的起始阶段[1]。
2 抑制肿瘤转移
Ikeda K等[13]在实验性和自发性转移模型中研究了MG在肿瘤转移中的抗转移作用及其机制。通过实验性L5178Y- ML25淋巴瘤肝脾转移模型和实验性及自发性B16-BL6黑色素瘤肺转移模型研究了MG的抗肿瘤转移作用。腹腔注射2或10 mg/kg MG能显著抑制肝脾转移或肺转移。在自发性B16-BL6黑色素瘤肺转移模型中，在肿瘤接种前后多次腹腔注射MG 10 mg/kg，能显著抑制肺转移和原发肿瘤的生长。MG还能显著抑制B16-BL6细胞侵犯重建的基底膜，而并不影响细胞的生长。这些体内实验的结果显示，MG表现出强大的抗转移活性，其作用机制为抑制肿瘤细胞侵袭。
Nagase H等[14]的研究发现：MG和HK显著抑制人纤维肉瘤HT-1080细胞对基底膜的侵袭，作用呈剂量依赖性；抑制HT-1080细胞转移(浓度为100 μmol/L)；不影响细胞生长及对基底膜的粘附。紫杉醇和MG与HK的混合物对肿瘤侵袭和转移的抑制率分别为39.7%和43.5%。HT-1080细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-9)，在侵袭过程中降解细胞外基质。MG与HK能抑制MMP-9活性，可能与其抑制肿瘤侵袭有关。
3 抑制肿瘤血管形成
阻碍血管生成是MG抑制肿瘤增殖的作用机制之一。在C57BL/6小鼠的背部皮下或右后足趾移植B16-BL6细胞，分别定时ip给予各种剂量的MG。背部皮下移植肿瘤8 d后以及足趾移植21 d后切除肿瘤，分别检测肿瘤的大小及新生血管数。结果发现，MG对背部皮下移植及右后足趾移植均有抑制肿瘤增殖的作用，新生血管数也明显减少[15]。MG还能诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡[16]。MG 5～20 mmol/L浓度依赖性诱导VSMC凋亡，该效应可被caspase抑制剂z-VAD-fmk 50 mmol/L所阻断。MG显著增强caspase-3和caspase-9活性，降低线粒体电位。MG浓度依赖性下调Bcl-2水平，但并不影响Bcl-2相关性x蛋白(Bax)或Bcl-XL。在动物模型中，球囊血管成形术诱导的新生内膜形成可被MG显著抑制，同时Bcl-2蛋白水平下降。这些结果提示：MG通过线粒体死亡途径诱导VSMC凋亡。该效应是由下调Bcl-2蛋白水平介导的。
HK是一种无毒的血管形成抑制剂。在体外，HK抑制内皮细胞株SVR增殖。HK对原代培养的人内皮细胞的抑制作用强于对成纤维细胞的抑制，该抑制作用可被TNF-α(肿瘤坏死因子)相关性凋亡诱导配体的抗体所拮抗。在裸鼠体内，HK对血管肉瘤高度有效[17]。
4 抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化
MG和HK能抑制多种肿瘤细胞增殖：包括HeLa细胞[4]、B16-BL6、THP-1、BAE和HT-1080细胞株[9]，人鳞状细胞肺癌Ch37细胞株[1]和人淋巴样白血病细胞Molt 4B[5]。
在培养的人COLO-205和Hep-G2肿瘤细胞株中[3]，3～10 mmol/L MG能剂量依赖性抑制DNA合成，减少细胞数，但非变形细胞如角质形成细胞、成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，MG在这些浓度未发现细胞毒性。MG减少DNA合成且阻遏细胞周期停留在G0/G1期。MG诱导的细胞周期阻遏作用只发生在当周期蛋白-CDK系统被抑制、p21蛋白表达被放大时。在COLO-205细胞株皮下种植至裸鼠形成实体瘤模型中，MG腹腔注射可观察到85%以上出现的肿瘤消退。在这些肿瘤中，可观察到p21蛋白水平表达增加。
Fong WF等[18]研究发现，低剂量的1，25-双羟维生素D3(VD3)和全反式维甲酸(ATRA)能诱导人白血病细胞株HL-60分化，MG与HK能增强该作用。10～30 mmol/L MG或HK处理后，表达膜分化标志CD11b和CD14的细胞增加至占总数的8%～16%，而阴性对照组仅为4%。加用1 mmol/L VD3后，MG或HK增加表达标志的细胞数从原来的30%增至50%～80%；在MG或HK处理的细胞中加入20 nmol/L ATRA，表达CD11b的细胞从9%增至24%～70%，而表达CD14的细胞数不变。在同等条件下，把MG或HK加入到VD3或ATRA处理的细胞中，结果发现G0/G1期细胞数增加，p27(Kip1)表达增加。p27(Kip1)是一种周期蛋白依赖性激酶抑制剂，利用MEK抑制剂PD098059、p38 MARK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125的研究结果显示：对在VD3和ATRA诱导的分化和MG或HK增强该分化作用的过程中，MEK途径起了重要的作用；p38 MARK途径起了抑制作用，而JNK途径与此无关。可见，MG和HK是强大的分化增强剂，它们可与低剂量VD3和ATRA联合用于治疗急性早幼粒细胞白血病。
5 阻断核因子NF-κB活化
NF-κB是调控了参与肿瘤血管生成、转移和细胞存活的一系列基因。在4种肿瘤细胞株中，TNF-α诱导的NF-κB激活可被HK阻断。HK不直接影响NF-κB与DNA结合，而是抑制由TNF-α激活的胞液内NF-κB抑制剂IKBα的磷酸化和降解。HK还抑制内源性和TNF-α激活的上游IKB激酶(IKKs)活性，提示HK在阻断IKBα的磷酸化和降解中起了关键的作用。在HeLa细胞中，HK能抑制由TNF-α激活的和NIK(NF-κB诱导的激酶)、野生型IKKβ、活化的IKKα和IKKβ或p65亚单位的短暂转染和表达激活的虫荧光素酶表达。HK还可抑制NF-κB 的p65亚单位的核移位及磷酸化。HK抑制NF-κB调控的炎性和致癌基因产物，包括MMP-9、TNF-α、IL-8、ICAM-1和MCP-1。在NF-κB活化的细胞株中，HK能增强TNF-γ诱导的细胞凋亡。总之，HK通过抑制IKKs来抑制NF-κB活化和NF-κB调控的基因表达，可能是其抗肿瘤作用机制之一[19]。
6 逆转肿瘤耐药
在人多发性骨髓瘤(MM)细胞株和复发的难治性MM患者的肿瘤细胞中，HK表现出显著的细胞毒性。HK还能增强硼替佐米(bortezomib)诱导的MM细胞毒性和凋亡[10]。在B-CLL患者原代培养细胞中，HK能克服凋亡耐受性。用IL-4(支持B-CLL存活的一种细胞因子)预处理过的B-CLL细胞与HK孵育后出现凋亡。HK能增强氟达拉滨(fludarabine)、克拉曲滨(cladribine)或苯丁酸氮芥(chlorambucil)的细胞毒作用[7]。P-糖蛋白与大部分内源性和获得性肿瘤耐药有关，抑制P-糖蛋白表达是一种有效的逆转肿瘤药物耐药的方法。在人乳房MDR肿瘤细胞株MCF-7/ADR中，HK能下调P-糖蛋白的表达，同时细胞内药物积聚，对阿霉素敏感性部分恢复。
7 结语
近年来，从中草药中寻找安全有效的肿瘤化疗替代药物成为研究的热点之一。MG和HK在体内外对多种肿瘤具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤血管形成和诱导肿瘤细胞分化等作用，加之植物资源丰富，使其具有良好的研究价值和发展前景。
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