作者：艾凌云，吴延庆，宋小敏，陈琦，肖鲁闽，张诗渊，程晓曙，吴清华，苏海
【摘要】 目的 观察葛根素预处理对兔急性心肌缺血再灌注心肌的保护作用。方法 新西兰大白兔60只，分为5组。S组：假手术组；C组：实验对照组；P组：葛根素组；F组：氟伐他汀组；P+F组：联合给药组(葛根素+氟伐他汀)，每组12只。建立心肌缺血/再灌注模型，分析心肌梗死范围，用ELISA法测定心肌肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)。结果 与C组相比，P、F、P+F组心梗体积比明显减少(P&<0.01)；F组减少心梗体积比作用大于P组(P&<0.05)；P+F组比P、F组减少心肌梗死体积作用显著(P&<0.05)。非梗死区心肌IL-6、TNF-α含量比较：C、P、F、P+F组明显高于S组(P&<0.01)；P、F、P+F组明显低于C组(P&<0.01)；F组低于P组(P&<0.05)；P、F组与P+F组高于P+F组(P&<0.05)。结论 兔急性心梗再灌注时非梗死区心肌IL-6、TNF-α浓度升高；葛根素短期预处理可以抑制炎症反应，减少心梗体积比；氟伐他汀作用大于葛根素；葛根素联合氟伐他汀作用大于单用葛根素或氟伐他汀。
【关键词】 葛根素；氟伐他汀；心肌缺血；再灌注损伤
Abstract：Objective To investigate the protective effect of Puerarin and/or Fluvastatin pretreatment on myocardium suffered from rabbit acute myocardial ischemia/reperfusion injury (IRI). Methods Sixty rabbits were pided to 5 groups randomly (n=12)：the sham-operated group (S group)， the control group (C group)， Puerarin group (P group)， Fluvastatin group (F gruop)， Puerarin + Fluvastatin group (P+F group). Myocardial is Chemia/reperfusion model was made and AMI aeas were analyzed by photoshop 8.0. TNF-α， IL-6 of cardic muscle and blood were evaluated by ELISA method. Results The volume ratio of infarction was obviously decreased in experiment group compared with C group (P&<0.01). F group decreased the volume ratios of infarction was better than the P group (P&<0.05). P， F group increased the volume ratio of infarction better than P+F group (P&<0.05). The level of the IL-6， TNF-α were decreased in experiment group and C group compared with S group (P&<0.01). The experiment group obviously decreased the level of IL-6， TNF-α compared with C group (P&<0.01). F group decreased the level of IL-6， TNF-α better than the P group (P&<0.05). P group or F group increased the level of IL-6， TNF-α better than P+F group (P&<0.05). Conclusion IRI contribute to the increase of TNF-α and IL-6 in rabbit myocadium. Either short-term pretreatment of Puerarin or Fluvastatin could decrease the volume ratio of infarction and alleviate the injury of myocardium by inhibiting inflammation. The effect of Fluvastatin pretreatment was better than Puerarin pretreatment. And the effect of combination was better than Puerarin or Fluvastatin pretreatment.
Key words：Puerarin；Fluvastatin；myocardial ischemia；reperfusion injury
葛根素注射液是辅助治疗冠心病(CHD)等疾病的一种药物，有减少心梗面积、抑制血小板聚集、改善高粘血症、高凝血症、改善微循环并有广泛的β受体阻滞剂作用，可抗心律失常、降压、扩张冠状动脉，保护心肌超微结构[1-3]。但其是否能通过减少急性心肌缺血再灌注时炎症浸润，进一步减少心梗面积还未见研究报道。他汀类药物可以通过减少急性心肌缺血再灌注时炎症浸润而减少对心肌的损害，减小心梗面积[4]。本研究通过观察葛根素、氟伐他汀短期单用或合用能否减少急性心肌缺血/再灌注时炎症浸润而对心肌起保护作用，减少心肌梗死面积，并通过与氟伐他汀保护作用对比，进一步评价葛根素对心肌缺血/再灌注损伤时心肌的保护作用。
1 实验材料
1.1 药物和试剂
葛根素(布瑞宁)，北京四环科宝制药有限公司产品；氟伐他汀(来适可)，北京诺华制药有限公司产品；Rabbit TNF-α IL-6 ELISA试剂盒，RapidBio Lab.公司产品；1%TTC(氯化三苯基四氮唑)的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，南京建成生物制品研究所产品。
1.2 动物
健康雄性新西兰大白兔，体重(2.0±0.2)kg，南昌大学医学院动物实验中心提供。
1.3 仪器
TUPC-1221型紫外分光光度计，北京通用仪器设备厂产品。品DH-150型小动物呼吸机，浙江医科大学仪器厂产品。FSH-2型可调高速匀浆器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司产品。CARDIMAX FX-2115型心电图机 北京福田电子医疗仪器有限公司产品。FA2004型电子天平，上海天平厂产品。
1.4 动物及分组
健康雄性新西兰大白兔60只，随机分为5组(每组12只)。S组：假手术组(剪开心包，穿线而不结扎冠状动脉，不用药物干预)；C组：实验对照组(冠脉结扎后松开，建立急性心肌缺血/再灌注模型，不用药物干预)；P组：葛根素组[葛根素20 mg/(kg?d)加入40 mL生理盐水经家兔耳缘静脉推注3 d，术前再给药1次)]；F组：氟伐他汀组[氟伐他汀20 mg/(kg?d)口服3 d，术前1 h再给药1次)]；P+F组，联合给药组[葛根素20 mg/(kg?d)加入40 mL生理盐水经家兔耳缘静脉推注3 d及氟伐他汀20 mg/(kg?d)口服3 d，术前1 h再给药1次]。其中，每组6只测心梗面积，6只检测生化指标。
2 实验方法
2.1 兔急性心肌缺血/再灌注模型
用3%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉。颈部正中切口气管插管后行呼气末正压人工通气，频率3O次/min，潮气量10 mL/kg，同步记录心电图观察ST变化。参照simpsond的方法[5]加以改进。沿胸骨中线切开皮肤，暴露胸骨，沿胸左缘剪断1根肋软骨，用小开胸器轻轻撑开胸腔切口，可见心包及搏动之心脏。提起心包膜，剪开心包膜前部，用止血钳将左心耳轻轻提起，用滑线持小圆针在左旋回支起点下0.5 cm处穿线环绕动脉，打活结结扎1 h，再灌时，松开活结2 h。经2 h再灌注后采集静脉血检测血清肌钙蛋白(TnCⅠ)。模型成功的标志：结扎后出现心电图Ⅰ、AVL导联ST段弓背向上抬高、T波高耸及TnCⅠ明显升高等表现，放松结扎线后，抬高的ST段下降大于1/2为梗死/再灌模型成功。心肌TTC染色后，可见正常心肌被染成红色，梗死区心肌不染色而显灰白色。
2.2 心肌梗死范围的测定
再灌注2 h后将兔处死，取心脏去除心房组织后，用滤纸吸干水分，垂直心脏长轴从心尖部开始将心脏切成5 mm厚薄片，放入1%TTC液37 ℃进行染色30 min，见梗死心肌未染色而存活心肌染成深红色，10%福尔马林固定24 h，取出用滤纸吸干，再用数码相机摄片，由photoshop 8.0软件分析心肌梗死范围。
2.3 心肌组织生化指标测定
取非梗死区心肌组织按9 mL/g比例用4 ℃生理盐水制备组织匀浆，匀浆后的组织匀浆液分装于玻璃试管及eppendroff 离心管中，冻于-70 ℃低温冰箱中备用。按试剂盒方法测定每克心肌组织中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量。
2.4 统计学方法
计量资料均以x±s表示，运用SPASS11.5软件进行统计学处理，多组间先行方差齐性检验，方差齐者行方差分析，不齐行秩和检验，用t 检验行组间两两比较。
3 结果
4 讨论
近年的研究提示，急性心肌缺血再灌注损伤与炎症密切相关，早期急性炎症反症在急性心肌缺血再灌注损伤中起重要作用[5-7]。早期急性炎症反应时，局部损伤组织中释放的TNF-α、IL-6介导、趋化大量白细胞向缺血损伤组聚集，机械阻塞毛细血管，产生氧自由基，剌激血管内皮细胞等产生的更多TNF-α、IL-6等炎症因子，介导、促进一系列炎症因子及炎症相关物质的基因转录和蛋白合成，如：内皮细胞粘附分子-1 (ECAM-1)、胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)，这些物质介导、趋化血液中更多炎症细胞，到达缺血区心肌，释放超氧阴离子、花生四烯酸代谢产物(如血栓烷A2等)和蛋白水解酶，特别是弹性蛋白酶，直接损伤缺血区心肌细胞，加重心肌收缩和舒张功能障碍，同时超氧阴离子直接损伤 缺血区内皮细胞膜，破坏内皮源性舒张因子(EDRF)，血栓烷A2收缩小冠状动脉，通过减少缺血组织血流量而有利于白细胞聚集，弹性蛋白酶损伤内皮，使更多白细胞滚动、粘附并浸润心肌缺血区进一步加重缺血区心肌损伤，扩大了心梗面积。检测梗死区周围心肌TNF-α、IL-6的浓度，可间接反映心肌炎症浸润情况及心肌损伤程度。
葛根素提取物是豆科属植物葛根中的有效提取成分，其主要成分有葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷元、大豆苷、柒料木素等，其中葛根素化学名为4，7一二羟基，8-β-D葡萄糖异黄酮。本研究发现，在建立兔急性心肌缺血/再灌注模型后2 h，实验对照组兔非梗死区心肌IL-6、TNF-α含量明显升高，而葛根素短期预处理组，梗死区体积比小于实验对照组，非梗死区心肌IL-6、TNF-α含量均低于实验对照组，这提示葛根素短期预处理可能通过减少再灌注时心肌IL-6、TNF-α含量，减少一系列炎症因子及炎症相关物质的基因转录和蛋白(ECAM-1、ICAM-1、VCAM-1)合成，从而减少血液中炎症因子向梗死区心肌趋化、浸润，进而起到保护缺血心肌，减少心梗面积的作用。笔者还发现葛根素联合氟伐他汀短期预处理减少再灌注时心肌IL-6、TNF-α含量，减少心肌梗死面积作用较单用葛根素或氟伐他汀显著，提示葛根素具有协同氟伐他汀抑制家兔缺血再灌注损伤时心肌炎症反应，保护缺血心肌作用。
上述结果表明，兔急性心梗再灌注时非梗死区心肌IL-6、TNF-α浓度升高；氟伐他汀抑制炎症反应、减少心梗范围作用优于葛根素；两药联合作用优于单用葛根素或氟伐他汀。
【参考文献
】
[1] 刘素云，李拥军，齐华阁，等.葛根素注射液对急性心肌梗死患者梗死面积及心功能的影响[J].中华心血管病杂志，2001，7(29)：394－396.
[2] 卢金萍，任江华，姚述远.葛根素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国现代应用药学杂志，2002，2(2)：65－68.
[3] 顾顺忠，王志明.葛根素对急性前壁心肌梗死患者梗死面积及心功能的影响[J].右江医学，2004，2(32)：140－141.
[4] Marc Horlitz，Ulrich Sigwart，Josef Niebauer.Fighting restenosis after coronary angioplasty：contemporary and future treatment options[J].International Journal of Cardiology，2002，83：199－205.
[5] Strandberg TE，Vanhanen H，Tikkanen MJ. Effect of statins on C-reactive protein in patients with coronary artery disease[J]. Lancet，1999，353：118—119.
[6] Maseri A. Inflammation atherosclerosis and ischemic events- exploring the hidden side of the moon[J].N Engl J Med，1997， 336(14)：1014－1016.
[7] 吴贤仁，杨 敏.急性心肌梗死患者炎性细胞因子水平的动态变化及意义[J].中华中西医杂志，2004，10(5)：35－38.