关于高效液相色谱法测定坤舒康颗粒中丹酚酸B的含量

　　　　 作者：冯梅梅 高淑丽 刘敏彦

【摘要】 　　目的 建立坤舒康颗粒中丹酚酸B的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以甲醇—乙腈—甲酸－水(30∶10∶0.5∶59.5)为流动相，检测波长：286 nm，流速：1 mL/min。分别进行线性关系、精密度试验、稳定性试验、重现性试验、阴性试验、加样回收率试验及耐用性试验考察。结果 丹酚酸B浓度在0.145～2.90 μg范围内呈良好线性关系；仪器精密度良好；供试品溶液稳定性良好；方法重现性良好；在丹酚酸B色谱峰处未出现色谱峰，表明阴性对照品溶液中组分不干扰丹酚酸B的测定；工艺基本稳定。结论 高效液相色谱法适用于坤舒康颗粒中丹酚酸B的含量测定。

【关键词】 色谱法 高压液相 丹参

　　【Abstract】 Objective To establish a method for determination of Salvianolic acid B in Kunshukang granule. Methods RP-HPLC method with C18 Column was used， the mobile phase was a mixture of Methanol -Formic acid- Acetonitrile Water (30∶10∶0.5∶59.5)， the detection wavelength was at 286 nm， flow rate was 1ml/min. Precision， stability， reproducibility， negative test and recovery of HPLC method were detected. Results The precision， stability and reproducibility of the method were good. The linear correlation was observed from 0.145 to 2.90 μg， r=0.9999. The average recovery was 98.64%. Conclusion The methods provided in this paper could be used for determination of Salvianolic acid B in Kunshukang powder.
　　
　　【Key words】 HPLC， Kunshukang powder; Salvianolic acid

　　坤舒康颗粒主要由丹参、蒲公英、赤芍药等药组成，具有清热利湿、解毒活血、化瘀止痛之功。临床主要用于腹痛带下、疒徵瘕积聚、小腹胀满疼痛等病症。坤舒康颗粒为复方制剂，其中丹参为方中君药，为有效控制其质量，采用高效液相色谱法测定了丹参中丹酚酸B的含量。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　美国Agilent 1100系列高效液相色谱仪；超声波清洗仪（KQ-250B，250W，昆州市超声仪器有限公司）。

　　1.2 试药

　　丹酚酸B对照品（批号：11562-200605，购自中国药品生物制品检定所）；坤舒康颗粒（河北省石家庄市第四医院制剂室自制，批号：050801、050802、050803）；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国fisher公司生产），水为乐百氏纯净水，其它试剂均为分析纯。

　　2 方 法

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶0.5∶59.5）；检测波长：286 nm；流速：1 mL/min；柱温：20℃。理论板数按丹酚酸B峰计算不得低于3 000。

　　2.2 溶液的制备

　　2.2.1 供试品溶液的制备

　　精密称取坤舒康颗粒0.5 g，研细，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理20 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

　　2.2.2 丹酚酸B对照品溶液的制备

　　精密称取丹酚酸B对照品14.50 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（浓度：0.145 mg/mL）。

　　2.2.3 阴性对照品溶液的制备

　　按坤舒康颗粒的制备方法制成不含丹参的模拟制剂即阴性对照品。精密称取阴性对照品0.5 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 线性关系考察

　　精密吸取浓度为0.145 mg/mL的丹酚酸B对照品溶液，分别进样1、2、5、10、20 μL，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。对所测得的峰面积（Y）和对照品进样量（X）作回归处理，绘制标准曲线。

　　2.3.2 精密度试验

　　精密吸取丹酚酸B对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，连续进样6次，测定峰面积。

　　2.3.3 稳定性试验

　　精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、12 h进样1次，测定峰面积。

　　2.3.4 重现性试验

　　取同一批坤舒康颗粒（批号：050801），分别取高、中、低3个样品量（0.6、0.5、0.4 g），每个样品量3份，按供试品溶液的制备方法制备，分别进行提取，测定。

　　2.3.5 阴性试验

　　精密吸取阴性对照品溶液、丹酚酸B对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件进行测定。

　　2.3.6 加样回收率试验

　　精密称取已知丹酚酸B含量的同一批（批号：050801）坤舒康颗粒9份，每份约0.25 g。置100 mL量瓶中，分别按高、中、低3种剂量分别加入丹酚酸B对照品溶液，各3份，按供试品溶液的制备方法制备，在上述色谱条件下测定，计算丹酚酸B的平均回收率和RSD值。

　　2.3.7 耐用性试验

　　取同一批供试品（批号：050801），改变甲酸用量（用量分别为0.1%、0.5%、1%）进行测定。改变检测波长（284、286、288 nm）进行测定。改变柱温（15、20、25℃）进行测定。采用以上色谱条件，分别用Phenomenex Gemini C18（5 μm，4.6×150 mm）色谱柱、Waters Symmetryshield C18（5 μm，4.6×150 mm）色谱柱、Phenomonex Luna C18（5 μm，4.6×250 mm)色谱柱进行测定。

　　3 结 果

　　3.1 线性关系考察

　　丹酚酸B浓度在0.145～2.90 μg范围内呈良好线性关系，回归方程为:Y=1203.7132X-6.9656，r=0.9999。

　　3.2 精密度试验

　　丹酚酸B对照品峰面积的RSD为0.65%，表明仪器精密度良好。

　　3.3 稳定性试验

　　在测定的12 h内，供试品的峰面积RSD值为0.88％，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

　　3.4 重现性试验

　　9次丹酚酸B 的含量测定结果RSD为1.91%，表明方法的重现性良好。

　　3.5 阴性试验

　　在丹酚酸B色谱峰处未出现色谱峰，表明阴性对照品溶液中组分不干扰丹酚酸B的测定，见图1、2、3。

　　3.6 加样回收率试验

　　丹酚酸B的平均回收率为98.64％，RSD为0.79％（n＝9）。结果见表1。表1 丹酚酸B加样回收率试验结果（略）

　　3.7 耐用性试验

　　①取同一批供试品（批号：050801），改变甲酸用量（用量分别为0.1%、0.5%、1%）进行测定，结果RSD为2.21％。②取同一批供试品（批号：050801），改变检测波长（284、286、288 nm）进行测定，结果RSD为0.67％。③取同一批供试品（批号：050801），改变柱温（15、20、25℃）进行测定，结果RSD为2.08％。④取同一批供试品（批号：050801），更换不同的色谱柱进行测定，结果RSD为2.18％。

　　3.8 样品测定

　　按本文色谱条件，对中试3批样品（批号：050801、050802、050803）进行了含量测定，并计算了转移率，分别为39.85%、41.62%、40.24%，平均转移率为40.57%，说明工艺基本稳定。

　　4 讨 论

　　4.1 本观察采用紫外分光光度法［1］，在200～700 nm范围内对丹酚酸B对照品进行了光谱扫描，结果丹酚酸B在255、286 nm处有最大吸收值，由于286 nm处吸收值比255 nm处值大，故选择286 nm作为本观察检测波长，以提高检测的灵敏度。

　　4.2 有关色谱条件中甲酸用量的选择 在试验中曾考察了甲酸用量对色谱图的影响，结果发现当甲酸用量在0.1%～1%之间时，丹酚酸B吸收峰的对称性及与杂质峰的分离度均较好，但当甲酸用量超过1时，峰形对称性较差，故本文将甲酸用量规定为0.5%，即流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶0.5∶59.5）。

　　4.3 本文对丹酚酸B测定时的柱温进行了考察，主要进行了10、15、20、25、30℃的考察，结果发现当柱温在10℃和30℃时，峰形较差，且测定结果差异较大，故为保证测定结果的准确性，本文在测定时将柱温规定为15～25℃。

参考文献