ING4 和HIF1α在人脑不同级别星形细胞瘤中表达的分析

　　　　 作者：赵树鹏 牛光明 陶胜忠 张鹏远 宋乐 尹先印 苏芳忠

【摘要】 目的 研究ING4及HIF1α在星形细胞瘤中的表达，探讨它们在星形细胞瘤发生和发展中的作用。方法 采用免疫组化法检测45例星形细胞瘤标本及11例正常脑组织中ING4和HIF1α的表达。结果 ING4在正常脑组织和星形细胞瘤中的阳性表达率分别为100%、42.4%;Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤中的阳性表达率分别为58.3%、23.8%，差异均有统计学意义(P&<0.05)。HIF1α在正常脑组织和星形细胞瘤中的阳性表达率分别为0、71.1%;在Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤中的阳性表达率分别为54.2%、90.5%，差异均有统计学意义(P&<0.05)。结论 ING4和HIF1α基因的表达与星形细胞瘤分级有密切关系，在其发生和发展过程中起重要作用。

【关键词】 ING4;HIF1α;星形细胞瘤;免疫组化

　　【Abstract】 Objective To research the expressions of ING4 and HIF1α in astrocytoma， and explore their roles in genesis and development of astrocytoma. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of ING4 and HIF1α in 45 cases of astrocytoma and 11 cases of normal brain tissues . Results The positive rates of the expression of ING4 in normal brain tissue and astrocytoma were 100%，42.4% respectively. The positive rates of the expression of ING4 in gradeⅠ～Ⅱand Ⅲ～Ⅳgrade astrocytoma were 58.3%， 23.8% respectively， the difference was significant(P&<0.05).The positive rates of the expression of HIF1α in normal brain tissue and astrocytoma were 0，71.1% respectively. The positive rates of the expression of HIF1α in gradeⅠ～Ⅱand Ⅲ～Ⅳgrade astrocytoma were 54.2%，90.5% respectively， the difference was significant(P&<0.05). Conclusion The expressions of ING4 and HIF1α genes have close relation to astrocytoma grade， which may play an important role in genesis and development of astrocytoma.

　　【Key words】 ING4; HIF1α; Astrocytoma; Immunohistochemistry

　　ING4基因是2003年发现的一种强的候选抑癌基因[1]，它通过抑制肿瘤血管增生、调控细胞增殖和凋亡及细胞的接触抑制等抑制肿瘤细胞的生长。缺氧诱导因子1α(HIF1α)是一种重要的转录因子，能促进肿瘤的血管生成，对肿瘤迅速增长起着重要的作用。本实验通过对45例星形细胞瘤标本中ING4和HIF1α蛋白检测，研究二者在星形细胞瘤发生和发展过程中的作用，为进一步揭示肿瘤的发病机制、诊断及治疗提供一定的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料 45例人脑星形细胞瘤均取自郑州大学第二附属医院神经外科200901～200907手术切除标本。男25例，女20例，年龄2～77岁，平均(41.8±18.3)岁。所有病例均为原发病例，术前未经放化疗。标本切除后中性福尔马林液固定保存，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，蜡块连续切片，厚约4 μm，HE染色后观察。按照2000年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准[2]，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级18例，Ⅲ级14例，Ⅳ级7例。把24例Ⅰ～Ⅱ级设为低度恶性实验组，21例Ⅲ～Ⅳ级设为高度恶性实验组。11例正常脑组织为对照组，取自脑外伤、脑出血、脑动静脉畸形病人内减压者。

　　1.2 方法 应用免疫组化法检测，厚约4 μm组织切片常规脱蜡，按SP盒说明进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，兔抗人ING4多克隆抗体和兔抗人HIF1α单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，所用两种兔抗人抗体的终浓度为1∶100。

　　1.3 染色结果判定 ING4阳性表达以细胞核和或胞浆内出现棕黄色颗粒为准， HIF1α表达于胞核或胞质，但主要是核表达，呈棕黄色。参考Hiroshi等[3]提到的方法，随机选10个高倍视野，依照细胞着色密度和着色强度半定量评分：(1)染色细胞百分比:未见染色为0分，≤25%细胞染色为1分，25%～50%细胞染色为2分，&>50%细胞染色为3分;(2)依阳性细胞染色强度:未见染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，上述两者之和的总得分来判定结果，&>2分定义为阳性表达(+)，≤2分定义为阴性表达(-)。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，统计方法采用χ2检验。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 ING4的染色结果 ING4阳性染色细胞可见细胞核和(或)胞浆内出现棕黄色或褐黄色均质颗粒，主要位于胞核，也可见于脑胶质细胞、脑锥体细胞、血管内皮细胞及间质纤维组织。正常脑组织均见表达，明显高于星形细胞瘤中的表达，且在Ⅰ～Ⅱ级组中阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ级组，差异均有统计学意义。见表1。表1 ING4蛋白在正常脑组织和星形细胞瘤中的表达注：脑组织与星形细胞瘤比较，χ2=11.864，P&<0.05;Ⅰ～Ⅱ级与Ⅲ～Ⅳ级比较，χ2=5.472，P&<0.05

　　2.2 HIF1α的染色结果 HIF1α阳性表达主要定位于肿瘤细胞核，部分位于胞浆内，呈黄色或棕黄色的染色颗粒，以肿瘤坏死区边缘最为明显。正常脑组织中未见表达，明显低于星形细胞瘤中的表达，且在Ⅰ～Ⅱ级组中的阳性表达率低于Ⅲ～Ⅳ级组，经统计学处理，差异有统计学意义(P&<0.05)。见表2。表2 HIF1α蛋白在正常脑组织和星形细胞瘤中的表达注：脑组织与星形细胞瘤比较，χ2=15.464，P&<0.05;Ⅰ～Ⅱ级与Ⅲ～Ⅳ级比较，χ2=7.188，P&<0.05

　　2.3 ING4和HIF1α之间的关联性 19例ING4表达阳性的星形细胞瘤中HIF1α表达阳性8例，26例ING4表达阴性的星形细胞瘤中HIF1α表达阳性24例，经χ2检验，两者呈负相关，相关系数r=-0.480。见表3。表3 ING4蛋白和HIF1α蛋白表达的关系

　　3 讨论

　　20世纪90年代，已认识到肿瘤是一种细胞周期调控异常性疾病，几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效应均与细胞生命活动异常有关[4]。ING4是生长抑制因子家族中的一个新成员，研究表明ING4能够与P300相互作用促使P53乙酰化，诱导细胞发生G2/M期周期阻滞，抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，且ING4还能抑制肿瘤血管的生成。ING4基因的缺失或突变，与多种肿瘤的形成有关。Suwon Kim等[5]通过比较基因组杂交技术(CGH)分析了ING4基因周围的缺失程度，发现T47D乳腺导管癌至少有两个拷贝的缺失。另外，Garkavtsev等[6]采用实时RTPCR的方法对50例神经胶质瘤和5例正常对照脑组织中ING4基因mRNA水平进行检测，结果显示ING4基因在神经胶质瘤中的表达下降，且与肿瘤恶性程度有关，级别越高表达水平越低。本实验结果与此一致。ING4蛋白在星形细胞瘤中表达降低，且与恶性程度呈负相关，提示ING4基因由于在星形细胞瘤中的缺失和突变，使肿瘤血管生成增多，细胞增殖加速和凋亡减少，是星形细胞瘤发病的关键因素。ING4有可能成为一个基因治疗的候选分子，通过对其表达的调控，进而有效地控制星形细胞瘤的发生发展。

　　HIF1α是一种重要的转录因子，可以诱导肿瘤细胞耐受缺氧状态，促进肿瘤血管的生成。研究表明HIF1α对VEGF及多种糖酵解酶起着转录调控作用，并促进肿瘤生长，与恶性肿瘤的关系密切。Zagzag等[7]对30例不同级别的胶质瘤和10例血管母细胞瘤研究发现高恶性胶质瘤比低恶性者的HIF1α表达强。同时Zhong等[8]对10例正常脑组织进行免疫组化染色，发现HIF1α蛋白表达均为阴性。本实验检测结果与此相符，并发现HIF1α蛋白在肿瘤缺氧坏死区边缘最为明显，且以高度恶性组多见，提示肿瘤细胞局部的缺氧使HIF1α基因转录，可以对下游基因VEGF及多种糖酵解酶起调控作用，促进肿瘤血管生长，在肿瘤细胞增殖、浸润和转移过程中起重要作用。

　　近期有文献报道ING4可通过抑制HIF1α的活性，减少IL8的表达，抑制肿瘤血管的生成，但具体机制尚不清楚，在星形细胞瘤中尚未见报道。2005年，Ozer等[9]发现ING4水平和细胞内低氧状态下诱导产生的HIF1α靶基因的表达呈负相关。结合本实验，在ING4阳性表达的星形细胞瘤标本中，HIF1α趋向为阴性表达，呈负相关(r=-0.480)。由此我们可以推测可能存在这一机制，ING4通过抑制HIF1α的活性，使其失去对下游基因VEGF及多种糖酵解酶的调控作用和减少IL8的表达，来减少肿瘤血管的生成，抑制肿瘤细胞的生长。总之，ING4的失活和HIF1α的激活共同参与了星形细胞瘤的发生和发展过程，但二者之间的相互作用机制有待进一步研究证实。进一步认识ING4和HIF1α在星形细胞瘤发病中的作用，可为肿瘤的治疗提供新靶点及新思路。

【参考文献】
　[1] Shiseki M，Nagashima M，Pedeux RM，et al. P2ING4 and P28ING5 bind to P53 and P300，enhance P53 activity[J].Cancer Res，2003，63(10):2 3732 378.

　　[2] Kleihues P，Cavenee WR.WHO classification of tumors pathology and genetics of tumors of the nervous system[J]. Lyon IARC Press，2000，1:253.

　　[3] Hiroshi K，Noriharu S，Shosaku A.Thymidine phosphorylase and vascular end dothelial growth factor in patients with stageⅠlung adenocarcinoma[J]. Cancer，2002，94:1 083.

　　[4] 郑杰，宋来君，孙红卫，等.Skp2和PTEN 在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义[J].中国实用神经疾病杂志，2008，11(1):911.

　　[5] Kim S，Chin K，Gray JW，et al.A screen for genes that suppress loss of contact inhibition: Identification of ING4 as a candidate tumor suppressor gene in human cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(46):16 25116 256.

　　[6] Garkavtsev I，Kozin SV，Chernova O，et al.The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumour growth and angiogenesis[J].Nature，2004，428(6980):328332.

　　[7] Zagzag D，Zhong H，Scalzihi JM ，et al.Expression of hypoxia inducible factor 1 alpha in brain tumors:association with angiogenesis，invasion， and progression[J].Cancer，2000，88(11):2 6062 618.

　　[8] Zhong H，De MarzoA M，Laughner E，et al.Overpression of hypoxiainducible factor 1 alpha in common human cancers and their etastases[J].Cancer Res，1999，59(22):5 8305 835.

　　[9] Ozer A，Wu LC，Bruick RK.The candidate tumor suppressor ING4 represses activation of the hypoxia inducible factor(HIF)[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(21)：7 4817 486.