作者：郭建功 高超旭 周毅擎 张东彬
论文关键词：荡石片 质量标准 薄层色谱法 高效液相色谱法
论文摘要 目的：研究与修订荡石片的质量标准。方法：采用TLC方法对荡石片中的茯苓、甘草进行定性鉴别；应用HPLC法，选用Hypersil C18色谱柱（4.6×200mm， 5μm），乙腈－0.5%磷酸(11∶89)为流动相，检测波长326nm，流速1.0ml/min，对荡石片中的绿原酸进行含量测定。结果：茯苓、甘草的TLC鉴别方法专属性强，操作简便。HPLC含量测定，绿原酸进样浓度在5.05～40.40μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.99999，n=5）；绿原酸的回收率为99.28％，RSD=1.16％。结论：本方法可对荡石片的主要药味进行准确的定性和定量测定，能更为有效的控制荡石片的质量。
荡石片是由苘麻子、蛤壳、玄明粉、石韦、茯苓、牛膝、海浮石、小蓟、甘草等九味药材制成的中药成方制剂，具有清热利水，通淋石功能。用于肾结石，输尿管、膀胱等泌尿系统结石。为控制产品内在质量，对方中药味茯苓、甘草进行了薄层色谱鉴别。方中石韦功效为利尿，泄热，清肺。用于小便不利，尿路感染，急性肾炎浮肿等，为方中主药。石韦与另一味中药小蓟均含有绿原酸成分，故我们选择用高效液相色谱法测定石韦和小蓟中绿原酸作为本品的质控指标。关于绿原酸的测定，目前已有大量的高效液相色谱法的报道[1]～[5]，该方法具有操作简便，准确，检测灵敏等优点。本文建立了HPLC法测定荡石片中绿原酸含量的方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
试验用荡石片样品由郑州市高新区意康药物研究所提供；绿原酸对照品（批号110753-200212，中国药品生物制品检定所提供，含量测定用）；茯苓药材对照品（中国药品生物制品检定所，批号121117-200504）；甘草对照药材（中国药品生物制品检定所，批号120904-200511）；
乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 TLC鉴别
2.1 茯苓的TLC鉴别 取本品20片，除去薄膜衣，研细，加乙醚50ml，加热回流提取1小时，滤过，放冷，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取茯苓对照药材2g ，同法制成对照药材溶液。取缺茯苓阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－丙酮－乙酸乙酯(85∶15∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上不显相同颜色的荧光斑点（见图1）。
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图1 茯苓的薄层色谱鉴别
1. 1号样品 2. 2号样品 3. 3号样品 4. 茯苓对照药材 5. 缺茯苓阴性样品
2.2 甘草的TLC鉴别 取本品30片，除去薄膜衣，研细，加乙醇30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，加乙醇20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。取缺甘草阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取对照品溶液2μl、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(40∶10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上不显相同颜色的斑点（见图2）。
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图2 甘草的薄层色谱鉴别
1. 1号样品 2. 2号样品 3. 3号样品 4. 甘草对照药材 5. 缺甘草阴性样品
3 含量测定
3.1 色谱条件 Hypersil C18色谱柱（4.6×200mm， 5μm）；乙腈－0.5%磷酸(11∶89)为流动相；流速1.0ml/min，检测波长为326nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。
上述色谱条件参照《中国药典》2010年版一部第83页石韦项下【含量测定】项下方法拟订，在上述条件下，绿原酸峰与相邻色谱峰可获得基线分离，分离度大于1.5。
3.2 溶液的制备
3.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品5.05mg，置25ml棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取1ml，置10ml棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得（每1ml含绿原酸20.20μg）。
3.2.2 供试品溶液制备 取本品20片，精密称定，研细，取约1.0g， 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml， 密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
3.2.3 缺石韦和小蓟的阴性对照溶液的制备 依据处方中的比例，按制法制备缺石韦和小蓟的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
3.3 阴性干扰试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，在绿原酸相同出峰时间处，阴性对照溶液色谱不出峰，表明阴性对照不干扰本品测定。
3.4 线性关系的考察 精密取绿原酸对照品溶液，制成浓度分别为5.05ug/ml、10.10 ug/ml、20.20 ug/ml、30.30 ug/ml、40.40 ug/ml的溶液，分别注入高效液相色谱仪，进样量10μl，记录绿原酸峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，绿原酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y= 42.66348X + 2.20208e-1 相关系数r=0.99999；表明绿原酸在5.05～40.40μg/ml之间呈良好的线性关系。
3.5 精密度试验 取同一绿原酸对照品溶液10μl注入高效液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积，RSD为0.61%。
3.6 重现性试验 按照正文含量测定方法，取装量差异项下同一批号（批号：050614）样品，分别制备6份供试品溶液，分别进样测定绿原酸峰面积，计算绿原酸含量平均值为0.1983mg/粒，RSD=1.90%。
3.7 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：050614），分别在0、2、4、6、8小时进样10ul，测定绿原酸峰面积，RSD为1.12%。结果表明，供试品溶液在8小时内稳定。
3.8 加样回收率试验 取同一批号已知含量供试品（批号：050614；绿原酸含量0.1983mg/片）20片，精密称重，求得平均片重。研细，取约0.5g，精密称定，共取6份，均分别加入绿原酸对照品适量，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样量10μl，测定并计算回收率，结果见表1。
表1. 加样回收率试验
取样量（g） 样品中含量（mg） 加入量（mg） 测得值（mg） 回收率（%） RSD(%)
0.5143 0.2468 0.200 0.4494 101.3
0.5012 0.2405 0.200 0.4396 99.55
0.5065 0.2430 0.246 0.4858 98.70 1.16
0.5093 0.2444 0.246 0.4854 97.97
0.5012 0.2405 0.295 0.5339 99.46
0.5003 0.2400 0.295 0.5311 98.68
结果显示，本品的加样回收率均在95.0％～105.0％之间，符合要求。
3.9 样品含量测定与限度确定 按照上述含量测定方法，取中试六批样品分别制备供试品溶液进行含量测定，测定结果见表2。
表2. 样品测定结果
050612 0.210
050613 0.210
050614 0.206
050713 0.210
050714 0.211
050715 0.194
根据测定结果，考虑到生产过程中的合理损失及投料药材含量的差异，暂拟定本品中每片含石韦和小蓟以绿原酸(C15H10O5)计，不得少于0.15mg。
1.对照品色谱图
2.供试品色谱图
2.供试品色谱图3.阴性对照色谱图（缺石韦和小蓟）
图3 高效液相色谱图
4 讨论
4.1 荡石片为《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第10册中的品种，在执行标准中只有理化鉴别项目，建立石韦和小蓟中有效成分绿原酸的含量测定方法，可有效控制产品质量。
4.2 本文通过TLC鉴别研究，建立了处方药味中茯苓、甘草的薄层色谱鉴别方法，操作简便，灵敏，均使用对照药材为对照，专属性强。
4.3荡石片中可选择的测定指标很少，而选择主药石韦与另一味小蓟中共含的有效成分绿原酸进行HPLC测定，是一种较为理想的测定方法。我们在《中国药典》（2010年版一部）石韦含量测定的基础上，参照部分文献，通过测定绿原酸含量，使绿原酸峰与相邻色谱峰达到了基线分离，达到了改进和提高质量标准的目的。通过实验建立了高效液相色谱法测定成品中绿原酸的含量并拟定了含量限度，该方法操作简单、结果准确可靠。
参考文献
[1] 袁学勤，迟静波，胥云。HPLC测定野菊花中绿原酸的含量。中成药，2005，27(4):493～494.
[2] 苏建俊，丁野，雷玉萍。银翘解毒浓缩丸的质量标准研究。中国药师，2005，8（6）：475～476。
[3]郑宜贵。ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定健儿清解液中绿原酸的含量。江西中医学院学报，2005，17(5):41。
[4]刘志辉，钱芳，张克勤。HPLC法测定感冒合剂中绿原酸含量。江苏药学与临床研究，2005，13(5):39～40。
[5]国家药典委员会.中国药典2010年版（一部）.北京：中国医药科技出版社，2010：83。
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